中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (9): 975-980
抑制天门冬氨酸受体对大鼠急性心肌梗死的影响
温霞,石少波,刘韬, 王丹丹,李然,王晞,唐艳红,杨波,黄从新     
430060 武汉,武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所
摘要目的 探讨抑制天门冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartate receptor,NMDAR)能否减少急性心肌梗死(心梗)后室性心律失常和心梗面积,为急性心梗防治提供实验依据。 方法 将45只SD大鼠随机(随机数字法)分为假手术组、心梗组和心梗+MK801组(NMDAR特异性抑制剂,治疗组),给药1周后,结扎冠状动脉左前降支制作急性心梗模型;记录心梗后30 min内的室性心律失常,再植入心电图记录器,记录24 h室性心律失常发生的情况;用病理学方法检测缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的表达、凋亡小体和心梗面积;用Western blot 检测左心室NMDAR的表达量。 结果 与假手术组比较,心梗组左心室NMDAR表达量升高(1.12±0.09)vs.(0.54±0.06), P<0.01。与心梗组比较,治疗组心梗后30 min和24 h室性心律失常发生率显著下降,差异均有统计学意义(P<0.01);Cx43分布均匀、表达量较高(1.68±0.27)% vs.(0.74±0.15)%,P<0.01;凋亡小体较少(13.49±3.25)% vs.(32.53±7.21)%,P<0.01;心梗面积显著下降(36.58±2.57)% vs.(43.72±3.11)%,P<0.01;而左心室NMDAR表达量下降(1.12±0.09)vs.(0.81±0.07), P<0.01。 结论 抑制NMDAR通过上调Cx43表达和抑制凋亡过程,进而减少大鼠急性心梗后室性心律失常和心梗面积。
关键词天门冬氨酸受体     急性心肌梗死     室性心律失常     凋亡    
Effect of N-Methyl-D-Aspartate receptor inhibition on acute myocardial infarction in rats
Wen Xia, Shi Shaobo, Liu Tao, Wang Dandan, Li Ran, Wang Xi, Tang Yanhong, Yang Bo, Huang Congxin     
Effect of N-Methyl-D-Aspartate receptor inhibition on acute myocardial infarction in rats
Corresponding author: Huang Congxin,Email: huangcongxin1951@163.com
Abstract: Objective To investigate the effects of N-Methyl-D-Aspartate receptor (NMDAR) inhibition on acute myocardial infarction (AMI) in respect of reduction in the incidence of ventricular arrhythmias (VAs) and infarct size inarat model in order to provide experimental evidence for the prevention and treatment of AMI. Methods Atotal of 45 Sprague-Dawley rats were randomly(random number) divided into Sham group, AMI group and AMI plus MK801 (a specific inhibitor of NMDAR) group (treatment group).The ligation of the left anterior descending coronary artery was performed to induce AMI, and the occurrence of VAs within 30 minutes period during the early stage of infarction was recorded. Then the telemetry ECG was implanted to record the incidence of VAs during the later 24-hour period. The histology staining was performed to measure the level of Cx43, apoptotic body and infarction size; and the expression of NMDAR protein was measured with western-blot. Results Compared with the sham group, the NMDAR expression was markedly increased in the MI group [(1.12±0.09)vs.(0.54±0.06), P<0.01]; Compared with the MI group, there was marked decrease in the incidences of VAs in treatment group during both 30 min period and 24 hour period (P<0.01).In addition, the higher Cx43 expression [(1.68±0.27)% vs.(0.74±0.15)%, P<0.01], fewer apoptotic bodies [(13.49±3.25)% vs.(32.53± 7.21)%, P<0.01], smaller infarction size [(36.58±2.57)% vs.(43.72±3.11)%, P<0.01] and lower NMDAR expression [(1.12±0.09)vs.(0.81±0.07), P<0.01] were found in the treatment group than those in MI group. Conclusions The NMDAR inhibition would protect against VAs and reduce infarct size in AMI rats, and the inhibition of Cx43 degradation and apoptosis may be the potential mechanism.
Key words: N-Methyl-D-Aspartate receptor     Acute myocardial infarction     Ventricular arrhythmias     Apoptosis    

天门冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartate receptor,NMDAR)是一种对Ca2+有高通透性的离子型谷氨酸受体,NMDAR也在心房肌、心室肌、传导系统、心脏内在神经纤维和神经节细胞等心脏部位上广泛分布[1, 2]。笔者先前的研究发现激活NMDAR会导致心脏结构和电生理异常,显著增加室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs)易感性[3, 4]。研究发现抑制NMDAR能够显著减少缺血-再灌注诱发的VAs,并能预防心肌病大鼠发生心脏性猝死(sudden cardiac death,SCD)[5, 6]。急性心肌梗死(简称心梗)是SCD最主要的病因,然而,抑制NMDAR是否对急性心肌梗死的进展有影响,以及具体机制如何,尚不清楚。为此,本研究试图探讨抑制NMDAR对急性心梗诱发的VAs和心梗面积的影响,为急性心肌梗死的临床防治提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物和分组

选用健康SPF级雄性成年Sprague-Dawley大鼠 (由武汉大学动物实验中心提供) 45只(280~300 g),进行1周适应性饲养后,随机(随机数字法)均分为三组:假手术组、心梗组和治疗组。治疗组动物在急性心梗模型制作前,按0.5 mg/(mL·kg)的浓度经腹腔给予MK801(NMDAR特异性抑制剂,Sigma公司,美国)连续治疗一周,另外两组动物均经腹腔给予等量的生理盐水1周。

1.2 急性心肌梗死模型制作

经1%浓度的水合氯醛(0.3 mL/kg)行腹腔注射深度麻醉后,通过口腔气管插管,接小动物呼吸机(江西特力公司),予100%的O2通气。从左胸第三肋处开胸,暴露心脏,剥离心包,于左心耳和肺动脉圆锥左下缘2 mm处结扎冠状动脉左前降支(LAD)。假手术组只穿线,不结扎。以LAD灌注区域心肌变白和Ⅱ导联ECG的T波高尖、ST段抬高为心梗制作成功的标准。

1.3 ECG记录

心梗制作过程中,按体表肢体Ⅱ导联记录心梗前和心梗后30 min的ECG;记录完成后,将遥测ECG记录仪(型号EA-F40,Data Science International公司,美国)植入动物体内,连续记录24 h,以记录VAs发生情况。本研究纳入的分析的VAs包括:(1)室速 连续3及以上的室性早搏;(2)室颤 QRS形态和频率不断变化,难以分辨,代之以形态不等、频率不规则的颤动样波。以VAs的个数、持续时间来比较各组VAs易感性。

1.4 病理学分析

在心电图记录24 h后,迅速脱臼处死动物,取出心脏,分离左心室 (每组随机4只)。经过10%福尔马林固定、石蜡包埋、切片等步骤将标本切除5 μm的组织,将切片分为两份。一份予抗缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)抗体(1∶ 500,Abcam公司,美国)孵育和荧光素标记。另一份采用细胞凋亡试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),运用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end-labelling,TUNEL)染色。将切片置于OLYMPUS BX51显微系统下拍摄,每个切片随机拍6张,再运用 Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司,美国)图像分析系统计算阳性的染色组织。Cx43表达量以阳性染色面积除以总面积表示,凋亡指数以凋亡小体个数除以细胞核总个数表示。

同上步骤处死动物(每组随机4只),迅速取出心脏,经主动脉注入1%的伊文氏篮,剪去心房和右室,经二尖瓣乳头肌水平将组织切成2 mm的薄片,经氯化三苯四氮嘬磷酸缓冲液孵育30 min,再经10%福尔马林固定24 h。经过上述染色过程,正常心肌染为蓝色,缺血心肌染为红色,坏死心肌染为灰白色。按上述拍摄和计算过程,分析各区的面积,心梗面积=(缺血区+坏死区)/总面积×100%。

1.5 Western blot分析

经上步骤处死动物(每组随机3只),迅速取出心脏,分离出左心室,置于-80 ℃冰箱保存备用。提取组织蛋白,BCA法定量,50 μg 样品上至10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转膜至PVDF膜(Millipore公司,德国)上,置于5%脱脂奶粉封闭液中摇床封闭2 h,取出后加入一抗(anti-NR1,1∶ 100,Abcam公司,美国),4 ℃孵育10 h。取出后TBST洗液 洗涤3 次,加入1∶ 2 000 稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记,Pierce公司,美国)中室温摇床孵育2h,再次用TBST 洗膜3次。暗室中将膜与ECL 反应2~8 min 后,压于X 线胶片上,后经显影、定影成像。以Actin作为内参,对蛋白定量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件处理分析数据,计量资料用均数±标准差(x±s)或中位数表示,多组间比较采用LSD-t检验或Nemenys秩和检验;计数资料用比值表示,组间比较用χ2检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 存活率比较

心梗模型制作过程中,假手术组、心梗组和治疗组分别有1、2和1只大鼠死亡,其余大鼠心梗模型均制作成功,心梗的ECG表现如下图 1;此后24 h后,假手术组、心梗组和治疗组分别有0、1和0只大鼠死亡;三组分别有14、12和14只大鼠纳入最终分析;三组大鼠生存率相近(14/15 vs. 12/15 vs. 14/15),差异无统计学意义(χ2=1.80,P=0.41)。

图 1 心梗前后Ⅱ导联ECG的变化 Fig.1 Changes in Ⅱ lead ECG before and after myocardial infarction
2.2 VAs易感性比较

急性心梗后30 min,心梗组发生VAs次数的中位数为12次,持续时间的中位数为17.53 s;与心梗组比较,治疗组VAs个数较少,持续时间较短;假手术只有偶发的VAs出现;三组间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。ECG遥测24 h,三组大鼠VAs易感性趋势未改变,心梗组最多,治疗组次之,假手术组最少,差异均有统计学意义(P<0.01)。见图 2

图 2 三组大鼠急性心梗后典型的室性心律失常表现 Fig.2 Typical VAs after myocardial infarction among three groups
2.3 Cx43和凋亡小体

免疫组化染色结果显示,假手术组大鼠左心室Cx43分布均匀,表达丰富(2.53±0.41)%,主要在心肌连接处呈线状或点状排列;在心梗组表达显著下降(0.74±0.15)%,分布散乱;而治疗组表达较心梗组多(1.68±0.27)%,分布较均匀;差异具有统计学意义(P<0.01)。TUNEL染色结果显示,心梗组大鼠左心室有大量凋亡小体分布(32.53±7.21)%,治疗组较少(13.49±3.25)%,而假手术组最少(2.18±1.04)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。治疗组大鼠左室心梗面积显著小于心梗组(36.58±2.57)% vs.(43.72±3.11)% ,P<0.01,见图 3

A:三组大鼠心脏典型的Cx43免疫组化图(X200)和凋亡小体TUNEL图(X200);B:三组大鼠心脏Cx43表达量、凋亡指数、心梗面积的比较;箭头表示阳性染色区;与假手术组比较,aP<0.01;与心梗组比较,bP<0.01 图 3 三组大鼠心脏Cx43表达、凋亡指数和心梗面积的比较 Fig.3 Comparison of Cx43 expression,apoptosis index and infarction area among three groups
2.4 NMDAR表达量

与假手术组比较,心梗组大鼠左心室NMDAR1表达量显著增加(1.12±0.09)vs.(0.54±0.06),P<0.01;而治疗组大鼠左心室NMDAR1表达量显著低于心梗组(1.12±0.09)vs.(0.81±0.07),P<0.01,见图 4

与假手术组比较,aP<0.01;与心梗组比较,bP<0.01 图 4 左心室NMDAR1表达量比较 Fig.4 Comparison of the NMDAR1 expression in left ventricle
3 讨论

既往关于NMDAR的研究主要集中在中枢神经系统,作为谷氨酸信号通路的关键受体之一,NMDAR不仅参与调控神经突触的形成、学习和记忆等生理过程,而且在脑卒中、阿尔海默氏综合征等多种中枢神经系统疾病中发挥重要的作用[2, 7]。近来,发现NMDAR也广泛分布于人类、大鼠、小鼠、恒河猴等哺乳动物的心脏中,因此推测NMDAR与心脏的病理生理过程有密切联系[1]。笔者先前持续慢性激活NMDAR两周,使心室钾通道蛋白减少,心肌间质纤维化,显著增加室性心律失常的易感性[3]。另外,Sun等[6]研究发现抑制NMDAR受体能够显著减少缺血-再灌注引起的心律失常然而其与急性心梗的关系还未得到研究。

本研究结果显示,心梗组大鼠NMDAR表达显著增加,提示NMDAR可能参与了急性心梗的病理过程中。MK801预治疗一周能够减少由心梗导致的Cx43降解,并显著降低超急性期(30 min)和亚急性期(24 h)室速和室颤的发生率,减少VAs的持续时间;还可抑制心肌凋亡过程,进而减少心梗面积。上述结果进一步提示NMDAR与急性心梗的发展密切相关,抑制NMDAR能够预防急性心梗进展和并发症。

VAs是急性心梗患者死亡的主要原因之一,约有20%的急性心梗患者将会发生致命性的室速或室颤,防治SCD是急性心梗重要的治疗目的[8, 9]。然而临床上仍有许多急性心梗患者死于SCD,这可能其复杂的机制有关。其中缝隙连接蛋白丢失、通道关闭是急性心梗的重要病理特征[10]。Cx43是主要的心室肌缝隙连接蛋白,它作为细胞间电信号和化学分子沟通的孔道,大大减少了心肌细胞间的阻力,让电化学信号在细胞间快速传播,使心室肌在功能上成为一个协调的整体[10]。急性心梗会导致大量的Cx43通道蛋白降解和关闭,一方面作为保护机制,使正常细胞免受酸性环境和毒性代谢产物的损害,另一方面阻滞了电冲动的传道,构成折返性通路,显著增加SCD的风险[11, 12]。本研究也证实,急性心梗后心室肌Cx43表达大量下降,分布不均匀,心肌端端连接缺失,而MK801预处理后Cx43表达下降相对较少,分布较均一,这将会大幅度减少电传导速度的异质性和阻滞的风险,进而减少室速或室颤的发生。

细胞凋亡是一种非能量消耗的程序性死亡,它在急性心梗病程中起着重要的作用。研究表明,凋亡是急性心梗心肌损伤的主要病理特征,凋亡有别于坏死,其高峰在心梗后4.5 h,而坏死在24 h,急性期凋亡程度是坏死的30倍,而心梗一周后凋亡过程仍然显著[13]。凋亡不仅在心梗急性期出现,在心肌修复、心脏重构起着关键作用,因此减少心肌细胞凋亡有望成为心梗治疗的一个靶点[14]。本研究发现,MK801显著抑制急性心梗后心肌凋亡,减少24 h的心梗面积,表明NMDAR与急性心梗后凋亡过程密切相关。既往研究证实,用NMDA(NMDAR激动剂)培养中枢神经细胞,显著增加细胞凋亡,呈浓度依赖性;而抑制NMDAR被证实能够有效地抑制脑卒中进展,减小脑梗死面积[15, 16]。本研究结果进一步提示,NMDAR也参与了急性心梗的病理过程,抑制NMDAR将有望成为一个治疗策略。

上述变化与NMDAR的功能特性有关,NMDAR是一种对Ca2+高通透的受体通道蛋白,心肌缺血时释放多种激活剂,如谷氨酸、同型半胱氨酸等,激活NMDAR,导致大量Ca2+内流[6]。Ca2+作为细胞电活动的离子,大量Ca2+内流将会导致心肌细胞Ca2+超载,使Ca2+操控紊乱,引起后除极、Ca2+活化等变化,最终导致心律失常的发生[17, 18]。另外,Ca2+作为细胞内重要的第二信使,介导多种信号通路,激活多种Ca2+依赖的蛋白酶,如钙调蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、金属基质蛋白酶等,参与底物蛋白的修饰和信号传导;还会启动线粒体的凋亡途径,是多种心脏疾病的重要发生机制和干预靶点[19, 20]。MK801抑制NMDAR受体,减少Ca2+内流,大幅降低了Ca2+引起的系列变化。本研究发现治疗组Cx43表达增加,可能与金属基质蛋白降解Cx43减少有关;而凋亡减少可能与MK801抑制Ca2+超载有关。

综上所述,NMDAR受体与急性心梗病理变化密切相关,抑制NMDAR显著抑制Cx43降解和凋亡过程,进而减少心梗急性期VAs的发生,限制心梗面积,将来有望成为新的治疗手段。

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