中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (8): 851-856
Nrf2基因过表达对百草枯诱导的骨髓间充质干细胞损伤的影响
蔡晓霞, 陈燕珍, 周挺, 赵光举, 邱俏檬, 洪广亮, 卢阳, 卢中秋     
325000 浙江省温州,温州医科大学附属第一医院急诊医学中心
摘要 目的 观察核因子E2相关因子2转录因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)基因过表达对百草枯(paraquat, PQ)诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)损伤的影响。 方法 BMSCs随机(随机数字法)分为6组:正常BMSCs组、BMSCs-mCherry(红色荧光蛋白)组、BMSCs-Nrf2组、BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组、BMSCs-Nrf2+PQ组。正常BMSCs组、BMSCs-mCherry组、BMSCs-Nrf2组:正常培养基培养;BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组、BMSCs-Nrf2+PQ组:终浓度1.0 mmol/L的PQ培养。24 h之后收集细胞及上清液,蛋白免疫印迹法(western blot)检测胞核内Nrf2蛋白量,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,化学比色法检测上清液脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量及过氧化氢酶(CAT)的活性,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液白细胞介素-6(IL-6)、IL-10及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。数据通过SPSS 20.0进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析。 结果 BMSCs-mCherry+PQ组与BMSCs+PQ组比较,各测定数据差异无统计学意义(P>0.05)。与BMSCs组比较,BMSCs+PQ组细胞核Nrf2蛋白表达量明显上升(P=0.008);与BMSCs+PQ组比较,BMSCs-Nrf2+PQ组Nrf2蛋白表达量升高(P=0.031)。与BMSCs组比较,BMSCs+PQ组细胞存活率明显下降,细胞凋亡率明显升高(P=0.000);与BMSCs+PQ组比较,BMSCs-Nrf2+PQ组细胞存活率明显升高[(53.27±2.40)% vs. (75.20±2.92)% ,P=0.000],凋亡数量显著降低[(26.43±2.21)% vs. (16.30±1.73)%,P=0.000]。与BMSCs组比较,BMSCs+PQ组MDA、IL-6、TNF-α水平明显上升,CAT、IL-10水平明显降低(P=0.000);与BMSCs+PQ组比较,BMSCs-Nrf2+PQ组MDA含量明显降低[(43.88±0.89) nmol/L vs. (37.29±1.88) nmol/L,P=0.000],上清液CAT活力明显升高[(22.82±0.63) U/mL vs. (38.45±1.24) U/mL,P=0.000], IL-6蛋白含量显著降低[(75.57±11.63) pg/mL vs. (52.00±5.87) pg/mL,P=0.001], IL-10的蛋白含量明显升高[(6.96±0.93) pg/mL vs. (15.59±1.73) pg/mL, P=0.000], TNF-α的蛋白含量显著降低[(164.51±9.29) pg/mL vs. (124.62±2.95) pg/mL, P=0.000]。 结论 Nrf2基因可明显提高BMSCs细胞核Nrf2蛋白的基础表达量,上调Nrf2-ARE通路的表达活性,抵抗PQ对BMSCs的损伤作用。
关键词Nrf2     百草枯     骨髓间充质干细胞     氧化应激    
Effect of Nrf2 overexpression damaged bone marrow mesenchymal stem cells induced by Paraquat
Cai Xiaoxia, Chen Yanzhen, Zhou Ting, Zhao Guangju, Qiu Qiaomeng, Hong Guangliang, Lu Yang, Lu Zhongqiu     
Emergency Department, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
Corresponding author: Lu Zhongqiu, Email: lzq640815@163.com
Abstract: Objective To observe the effects of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) overexpression on damaged bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) induced by paraquat (PQ). Methods BMSCs were randomly (random number) divided into six groups: normal BMSCs group,BMSCs-mCherry(Red flurescent protein) group,BMSCs-Nrf2 group,BMSCs+PQ group, BMSCs-mCherry+PQ group and BMSCs-Nrf2+PQ group. The BMSCs group,BMSCs-mCherry group and BMSCs-Nrf2 group were cultured by medium. The BMSCs+PQ group, BMSCs-mCherry+PQ group and BMSCs-Nrf2+PQ group were cultured by 1.0 mmol/L final concentration PQ. All cells and supernatant were collected at 24hafter culture in medium or in PQ. The nucleus protein level of Nrf2 was measured by Western blot; the cell viability was measured by CCK-8 assay; apoptosis of cells was detected by flow cytometry; the levels of malondialdehyde(MDA), catalase(CAT) in supernatant were determined by chemical colorimetry; the levels of interleukin (IL)-6, IL-10 and tumor necrosis factor (TNF)-α in supernatants were detected by Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) . One-way analysis of variance (AVOVA) was employed for statistical analysis by using SPSS version 20.0 to compare values among all groups. Results There were no significant differences in all biomarker variables between BMSCs+PQ group and BMSCs-mCherry+PQ group (P>0.05). Compared with BMSCs group,the nucleus protein level of Nrf2 in BMSCs+PQ group was higher markedly(P=0.008); compared with BMSCs+PQ group, the nucleus protein level of Nrf2 in BMSCs-Nrf2+PQ group was also higher(P=0.031). The cell viability was much lower in BMSCs+PQ group than that in BMSCs group, while the cell apoptosis was much higher in BMSCs+PQ group(P=0.000);compared with BMSCs+PQ group,the cell viability in BMSCs-Nrf2+PQ group increased remarkably [(75.20±2.92)% vs. (53.27±2.40)%(P=0.000)],and the cell apoptosis decreased significantly [(16.30±1.73)% vs. (26.43±2.21)%(P=0.000)]. The levels of MDA, IL-6, TNF-α in supernatant were much higher in BMSCs+PQ group than those in BMSCs group, while the levels of CAT and IL-10 were much lower in BMSCs+PQ group(P=0.000);compared with BMSCs+PQ group,the MDA, IL-6, TNF-α levels decreased remarkably in BMSCs-Nrf2+PQ group [MDA: (37.29±1.88) nmol/L vs. (43.88±0.89) nmol/L, P=0.000; IL-6: (52.00±5.87) pg/mL vs. (75.57±11.63) pg/mL, P=0.001; TNF-α:(124.62±2.95) pg/mLvs. (164.51±9.29)pg/mL, P=0.000], whereas the CAT and IL-10 levels in BMSCs-Nrf2+PQ group were markedly increased [CAT:(38.45±1.24)U/mL vs. (22.82±0.63) U/mL, P=0.000; IL-10:(15.59±1.73) pg/mL vs. (6.96±0.93) pg/mL, P=0.000]. Conclusion The Nrf2 gene can increase the nucleus protein level of Nrf2 in BMSCs and up-regulate Nrf2-ARE pathway, which have the obvious effects on protecting BMSCs against oxidative damages.
Key words: Nrf2     Paraquat     Bone marrow mesenchymal stem cells     Oxidative stress    

百草枯(paraquat,PQ)是一种强效的非选择性除草剂,对人畜有极强的毒性,目前认为氧化-抗氧化的失衡是PQ急性中毒肺损伤的主要原因[1, 2]。Nrf2是细胞内调节氧化应激的重要转录因子,与PQ中毒肺损伤密切相关[3],Nrf2过表达在纠正体内氧化还原失衡的同时还可抑制炎性因子的产生[4]。BMSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞[5],且具有抵抗PQ毒性的作用[6],减轻PQ中毒导致的肺损伤[7]。本实验使用慢病毒介导的Nrf2基因转染BMSCs,观察Nrf2基因过表达对PQ致BMSCs损伤的保护作用,从而为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料

Nrf2基因过表达的慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司,中国);Balb/c小鼠骨髓间充质干细胞、DMEM、Eni.s病毒转染增强液(苏州赛业生物科技有限公司,中国);PQ(Sigma公司,美国);胎牛血清、胰酶(Gibco公司,美国);抗Nrf2抗体(Abcam公司,美国);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、核蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术研究所,中国);CCK-8试剂盒(同仁化学研究所,日本);细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,中国);MDA、CAT化学比色检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);IL-6、IL-10、TNF-α ELISA检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,中国);流式细胞仪(BD公司,美国)。

1.2 细胞培养

复苏正常冻存BMSCs,培养箱中培养,24 h之后观察细胞贴壁状况并更换新鲜DMEM培养基。每2~3 d更换新鲜培养基,当细胞融合80%~90%时,胰酶消化并接种到培养瓶中继续培养。当细胞生长状态稳定后,可用于实验。

1.3 PQ对BMSCs的毒性实验

实验分为5组:空白对照组、0.6 mmol/L PQ组、0.8 mmol/L PQ组、1.0 mmol/L PQ组、1.2 mmol/L PQ组。将BMSCs用胰酶消化配成单细胞悬液接种于96孔培养板内,浓度为1×103细胞/孔,培养箱培养,24 h之后弃掉上层培养基,空白对照组加入新鲜培养基,其余各组分别加入终浓度为0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L的PQ,培养24 h之后弃掉上层培养基,严格按照CCK-8试剂盒操作,计算细胞存活率。

1.4 Lv-Nrf2转染BMSCs

BMSCs单细胞悬液接种在48孔培养板中,浓度为2×103/孔,培养24 h之后弃掉培养基,并以Eni.s增强液作为感染基质,感染复数(MOI)=10加入Lv-mCherry、或Lv-Nrf2,10 h后更换新鲜培养基,常规培养,72 h后荧光显微镜下观察病毒荧光表达情况,Western blot和PCR法分别检测细胞内Nrf2蛋白和Nrf2 mRNA的表达情况,各目的基因的引物序列如下,Nrf2上游:5′ GCC TGT AAG TCC TGG TCA TCGG下游:ACT GCT CTT TGG ACA TCA TTT CGTT3′ ,179 bp; β-actin上游:5′ CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA下游:AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC3′ ,564 bp。

1.5 BMSCs Nrf2蛋白、凋亡比例及细胞因子的检测

实验分为6组: BMSCs组、BMSCs-mCherry组、BMSCs-Nrf2组、BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组、BMSCs-Nrf2+PQ组。将BMSCs、 BMSCs-mCherry 或BMSCs-Nrf2分别接种于6孔培养板内,浓度为5×104细胞/孔,培养24 h后弃掉上层培养基,BMSCs组、BMSCs-mCherry组和BMSCs-Nrf2组加入新鲜培养基,BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组和BMSCs-Nrf2+PQ组加入终浓度为1.0 mmol/L PQ,24 h后收集细胞及上清液备用。(1)Western blot法检测Nrf2蛋白表达情况:将收集的细胞离心,严格按照核蛋白提取试剂盒操作要求,提取细胞核蛋白,以β-actin为内参检测Nrf2蛋白的表达情况;(2)细胞凋亡检测:严格按照细胞凋亡检测试剂盒操作,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;(3)化学比色法检测MDA含量、CAT活力变化:严格按照化学比色试剂盒操作,检测上清液MDA含量和CAT的活力变化;(4)ELISA法检测IL-6、IL-10和TNF-α含量:严格按照ELISA试剂盒操作,检测上清液IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.6 BMSCs存活率的检测

实验分为6组: BMSCs组、BMSCs-mCherry组、BMSCs-Nrf2组、BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组、BMSCs-Nrf2+PQ组。BMSCs、 BMSCs-mCherry或 BMSCs-Nrf2分别接种于96孔培养板内,浓度为1×103细胞/孔,培养24 h后弃掉上层培养基,BMSCs组、BMSCs-mCherry组和BMSCs-Nrf2组加入新鲜培养基,BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组和BMSCs-Nrf2+PQ组加入终浓度1.0 mmol/L PQ,24 h后弃掉上层培养基,严格按照CCK-8试剂盒操作,计算细胞存活率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件,计数资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,方差不齐则进行秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 PQ对BMSCs的毒性作用

随着PQ浓度增加,BMSCs存活率逐渐降低,且呈明显的浓度依赖关系,1.0 mmol/L PQ刺激细胞24 h,细胞存活率下降到(54.67±0.08)%,细胞损伤达半数,与空白对照组细胞存活率相比,差异具有统计学意义(P < 0.05),因此选定1.0 mmol/L为PQ的最适损伤浓度。见图 1

与空白对照组比较,aP<0.05 图 1 PQ对BMSCs 的毒性作用 Fig 1 The toxic effects of PQ to BMSCs
2.2 BMSCs的感染

病毒感染BMSCs 72 h后红色荧光表达显著增强,且被感染细胞数量达到80%以上;此时Nrf2蛋白、Nrf2 mRNA在BMSCs-Nrf2组的表达水平,与BMSCs组、BMSCs-mCherry组相比,均有显著增加(P < 0.05)。见图 2

A:光学显微镜下BMSCs形态;B:同一视野下Lv-Nrf2转染BMSCs(×200);C:Nrf2蛋白表达水平;D:Nrf2 mRNA表达水平;与BMSCs组比较,aP<0.05; 1:BMSCs组;2:BMSCs-mCherry组;3:BMSCs-Nrf2组 图 2 慢病毒转染BMSCs Fig 2 BMSCs transfected by Lv-Nrf2
2.3 Nrf2基因过表达对BMSCs Nrf2蛋白表达的影响

BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组Nrf2蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组相比,BMSCs+PQ组Nrf2蛋白表达水平明显增加(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组Nrf2表达水平显著增加(P < 0.05)。见图 3

与BMSCs组比较,aP<0.05;与BMSCs+PQ组比较,bP<0.05;1:BMSCs组;2:BMSCs-mCherry组;3:BMSCs-Nrf2组;4: BMSCs+PQ组;5: BMSCs-mCherry+PQ组;6:BMSCs-Nrf2+PQ组 图 3 BMSCs Nrf2蛋白的表达 Fig 3 The expression of Nrf2 protein of BMSCs
2.4 Nrf2基因过表达对BMSCs存活率的影响

BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组相比,BMSCs+PQ组细胞存活率明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组细胞存活率明显升高,差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图 4

与BMSCs组比较,aP<0.05;与BMSCs+PQ组比较,bP<0.05 图 4 CCK-8检测BMSCs存活率 Fig 4 Cell viability detected by CCK-8
2.5 Nrf2基因过表达对BMSCs凋亡的影响

BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组相比,BMSCs+PQ组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图 5

A:BMSCs组;B:BMSCs-mCherry组;C:BMSCs-Nrf2组;D: BMSCs+PQ组;E: BMSCs-mCherry+PQ组;F:BMSCs-Nrf2+PQ组 图 5 流式细胞术Annexin V/PI双染法检测BMSCs凋亡 Fig 5 BMSCs apoptosis detected using Annexin V/PI staining by flow cytometry
2.6 Nrf2基因过表达对BMSCs MDA、CAT、IL-6、IL-10、TNF-α表达水平的影响

BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组各检测指标比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组细胞相比,BMSCs+PQ组细胞经PQ刺激之后上清液中MDA、IL-6、TNF-α的含量明显增高,而CAT、IL-10的含量明显下降,差异均有统计学意义(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组上清液MDA、IL-6、TNF-α的含量有所降低,而CAT、 IL-10的含量显著增加,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 6

与BMSCs组相比,aP<0.05;与BMSCs-Nrf2组相比,bP<0.05; A:BMSCs组;B:BMSCs-mCherry组;C:BMSCs-Nrf2组;D:BMSCs+PQ组;E:BMSCs-mCherry+PQ组;F:BMSCs-Nrf2+PQ组 图 6 BMSCs细胞因子的表达 Fig 6 Expression of the cytokines in BMSCs
3 讨论

PQ通过产生大量氧自由基、诱发胞内线粒体凋亡和影响能量的合成及利用引发机体发生MODS和肺纤维化[8],卢晗等[9]研究发现体外使用具有抗氧化及抗炎作用的姜黄素可明显拮抗PQ诱导的A549细胞氧化损伤,提示氧化应激是PQ损伤的主要机制。

BMSCs是临床细胞治疗方法的理想种子细胞,实验研究发现BMSCs条件培养基可减缓PQ中毒引起的急性肺损伤[7],其机制可能与BMSCs自分泌/旁分泌作用有关。另外,BMSCs还具有“归巢”特性[10],可选择性地在受损器官处聚集并修复受伤的组织[11, 12],对PQ染毒大鼠肺损伤有显著的保护作用[13]。实验研究表明,在博莱霉素诱导的小鼠急性肺损伤模型中,BMSCs可迁移到受损的肺组织并分化为肺泡上皮细胞发挥治疗作用[14]。然而,由于细胞移植治疗的前期,BMSCs出现大量的死亡,限制了BMSCs在临床治疗组织损伤的能力。提高BMSCs抵御外界微环境变化的能力是十分必要的,因此本实验使用Lv-Nrf2转染BMSCs具有一定的可行性。

Nrf2具有调控细胞氧化还原环境的作用,是重要的抗氧化因子[15]。当细胞内环境改变时,Nrf2与抗氧化反应元件结合,启动抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达,提高细胞对外界有害环境的抵御能力。在呼吸机相关肺损伤小鼠模型中,与Nrf2+/+小鼠相比,Nrf2-/-小鼠氧化-抗氧化平衡破坏[16],小鼠的病死率显著增加。笔者以往实验结果也证实,姜黄素、沙利度胺等物质可通过激活Nrf2-ARE信号通路显著降低PQ诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞及急性中毒大鼠的病死率[9, 17],而在敲除Nrf2基因情况下,环木菠萝烯醇阿魏酸酯对PQ致HK-2细胞损伤的保护作用大大减低[3],说明PQ中毒与Nrf2基因有重要的联系。

MDA、CAT是机体内重要的氧化/抗氧化指标[18],其含量的多少可间接反映细胞内的氧化应激水平。本研究发现,PQ可直接导致BMSCs的内环境稳态失衡,细胞上清液中MDA含量明显升高,抗氧化因子CAT 活力降低;而Nrf2基因过表达可明显抑制PQ对BMSCs的损伤,说明Nrf2可抑制BMSCs的氧化应激损伤,进而降低细胞的病死率。Nrf2基因过表达抑制PQ对BMSCs损伤作用的机制还可能与Nrf2-ARE通路负调控NF-κB炎症通路有关,Nrf2基因过表达可导致NF-κB下游促炎症因子的表达下降[4, 19, 20],进而对细胞起保护作用。

线粒体途径是细胞凋亡的主要途径之一。实验研究发现Nrf2上游抑制因子Keap-1可与凋亡相关蛋白Bcl-2发生结合,激活caspase蛋白家族诱导细胞凋亡,而Nrf2基因上调可明显抑制Keap-1和Bal-2的结合,促进细胞稳定及细胞生存[21]。PQ中毒之后机体内有大量的活性氧蓄积,导致线粒体膜发生脂质过氧化,最终导致BMSCs凋亡,而Nrf2基因过表达可显著抑制PQ对BMSCs的促凋亡作用,表现为BMSCs的凋亡率明显下降,这可能与Nrf2及其下游蛋白转录增加从而抑制caspase蛋白家族的表达,进一步阻断细胞线粒体凋亡途径相关。

综上所述,Nrf2是细胞内抗氧化、抗凋亡、抗炎症通路的关键因子,其表达上调可明显抑制BMSCs的氧化应激损害及凋亡,显著提高BMSCs抵抗外界微环境变化的能力,从而为BMSCs治疗PQ导致的肺损伤的临床应用提供了理论依据。

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