百草枯(paraquat,PQ)是一种强效的非选择性除草剂,对人畜有极强的毒性,目前认为氧化-抗氧化的失衡是PQ急性中毒肺损伤的主要原因[1, 2]。Nrf2是细胞内调节氧化应激的重要转录因子,与PQ中毒肺损伤密切相关[3],Nrf2过表达在纠正体内氧化还原失衡的同时还可抑制炎性因子的产生[4]。BMSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞[5],且具有抵抗PQ毒性的作用[6],减轻PQ中毒导致的肺损伤[7]。本实验使用慢病毒介导的Nrf2基因转染BMSCs,观察Nrf2基因过表达对PQ致BMSCs损伤的保护作用,从而为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料Nrf2基因过表达的慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司,中国);Balb/c小鼠骨髓间充质干细胞、DMEM、Eni.s病毒转染增强液(苏州赛业生物科技有限公司,中国);PQ(Sigma公司,美国);胎牛血清、胰酶(Gibco公司,美国);抗Nrf2抗体(Abcam公司,美国);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、核蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术研究所,中国);CCK-8试剂盒(同仁化学研究所,日本);细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,中国);MDA、CAT化学比色检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);IL-6、IL-10、TNF-α ELISA检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,中国);流式细胞仪(BD公司,美国)。
1.2 细胞培养复苏正常冻存BMSCs,培养箱中培养,24 h之后观察细胞贴壁状况并更换新鲜DMEM培养基。每2~3 d更换新鲜培养基,当细胞融合80%~90%时,胰酶消化并接种到培养瓶中继续培养。当细胞生长状态稳定后,可用于实验。
1.3 PQ对BMSCs的毒性实验实验分为5组:空白对照组、0.6 mmol/L PQ组、0.8 mmol/L PQ组、1.0 mmol/L PQ组、1.2 mmol/L PQ组。将BMSCs用胰酶消化配成单细胞悬液接种于96孔培养板内,浓度为1×103细胞/孔,培养箱培养,24 h之后弃掉上层培养基,空白对照组加入新鲜培养基,其余各组分别加入终浓度为0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L的PQ,培养24 h之后弃掉上层培养基,严格按照CCK-8试剂盒操作,计算细胞存活率。
1.4 Lv-Nrf2转染BMSCsBMSCs单细胞悬液接种在48孔培养板中,浓度为2×103/孔,培养24 h之后弃掉培养基,并以Eni.s增强液作为感染基质,感染复数(MOI)=10加入Lv-mCherry、或Lv-Nrf2,10 h后更换新鲜培养基,常规培养,72 h后荧光显微镜下观察病毒荧光表达情况,Western blot和PCR法分别检测细胞内Nrf2蛋白和Nrf2 mRNA的表达情况,各目的基因的引物序列如下,Nrf2上游:5′ GCC TGT AAG TCC TGG TCA TCGG下游:ACT GCT CTT TGG ACA TCA TTT CGTT3′ ,179 bp; β-actin上游:5′ CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA下游:AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC3′ ,564 bp。
1.5 BMSCs Nrf2蛋白、凋亡比例及细胞因子的检测实验分为6组: BMSCs组、BMSCs-mCherry组、BMSCs-Nrf2组、BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组、BMSCs-Nrf2+PQ组。将BMSCs、 BMSCs-mCherry 或BMSCs-Nrf2分别接种于6孔培养板内,浓度为5×104细胞/孔,培养24 h后弃掉上层培养基,BMSCs组、BMSCs-mCherry组和BMSCs-Nrf2组加入新鲜培养基,BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组和BMSCs-Nrf2+PQ组加入终浓度为1.0 mmol/L PQ,24 h后收集细胞及上清液备用。(1)Western blot法检测Nrf2蛋白表达情况:将收集的细胞离心,严格按照核蛋白提取试剂盒操作要求,提取细胞核蛋白,以β-actin为内参检测Nrf2蛋白的表达情况;(2)细胞凋亡检测:严格按照细胞凋亡检测试剂盒操作,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;(3)化学比色法检测MDA含量、CAT活力变化:严格按照化学比色试剂盒操作,检测上清液MDA含量和CAT的活力变化;(4)ELISA法检测IL-6、IL-10和TNF-α含量:严格按照ELISA试剂盒操作,检测上清液IL-6、IL-10和TNF-α含量。
1.6 BMSCs存活率的检测实验分为6组: BMSCs组、BMSCs-mCherry组、BMSCs-Nrf2组、BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组、BMSCs-Nrf2+PQ组。BMSCs、 BMSCs-mCherry或 BMSCs-Nrf2分别接种于96孔培养板内,浓度为1×103细胞/孔,培养24 h后弃掉上层培养基,BMSCs组、BMSCs-mCherry组和BMSCs-Nrf2组加入新鲜培养基,BMSCs+PQ组、BMSCs-mCherry+PQ组和BMSCs-Nrf2+PQ组加入终浓度1.0 mmol/L PQ,24 h后弃掉上层培养基,严格按照CCK-8试剂盒操作,计算细胞存活率。
1.7 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件,计数资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,方差不齐则进行秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 PQ对BMSCs的毒性作用随着PQ浓度增加,BMSCs存活率逐渐降低,且呈明显的浓度依赖关系,1.0 mmol/L PQ刺激细胞24 h,细胞存活率下降到(54.67±0.08)%,细胞损伤达半数,与空白对照组细胞存活率相比,差异具有统计学意义(P < 0.05),因此选定1.0 mmol/L为PQ的最适损伤浓度。见图 1。
2.2 BMSCs的感染病毒感染BMSCs 72 h后红色荧光表达显著增强,且被感染细胞数量达到80%以上;此时Nrf2蛋白、Nrf2 mRNA在BMSCs-Nrf2组的表达水平,与BMSCs组、BMSCs-mCherry组相比,均有显著增加(P < 0.05)。见图 2。
2.3 Nrf2基因过表达对BMSCs Nrf2蛋白表达的影响BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组Nrf2蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组相比,BMSCs+PQ组Nrf2蛋白表达水平明显增加(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组Nrf2表达水平显著增加(P < 0.05)。见图 3。
2.4 Nrf2基因过表达对BMSCs存活率的影响BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组相比,BMSCs+PQ组细胞存活率明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组细胞存活率明显升高,差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图 4。
2.5 Nrf2基因过表达对BMSCs凋亡的影响BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组相比,BMSCs+PQ组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图 5。
2.6 Nrf2基因过表达对BMSCs MDA、CAT、IL-6、IL-10、TNF-α表达水平的影响BMSCs+PQ组与BMSCs-mCherry+PQ组各检测指标比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常BMSCs组细胞相比,BMSCs+PQ组细胞经PQ刺激之后上清液中MDA、IL-6、TNF-α的含量明显增高,而CAT、IL-10的含量明显下降,差异均有统计学意义(P < 0.05);与BMSCs+PQ组相比,BMSCs-Nrf2+PQ组上清液MDA、IL-6、TNF-α的含量有所降低,而CAT、 IL-10的含量显著增加,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 6。
3 讨论PQ通过产生大量氧自由基、诱发胞内线粒体凋亡和影响能量的合成及利用引发机体发生MODS和肺纤维化[8],卢晗等[9]研究发现体外使用具有抗氧化及抗炎作用的姜黄素可明显拮抗PQ诱导的A549细胞氧化损伤,提示氧化应激是PQ损伤的主要机制。
BMSCs是临床细胞治疗方法的理想种子细胞,实验研究发现BMSCs条件培养基可减缓PQ中毒引起的急性肺损伤[7],其机制可能与BMSCs自分泌/旁分泌作用有关。另外,BMSCs还具有“归巢”特性[10],可选择性地在受损器官处聚集并修复受伤的组织[11, 12],对PQ染毒大鼠肺损伤有显著的保护作用[13]。实验研究表明,在博莱霉素诱导的小鼠急性肺损伤模型中,BMSCs可迁移到受损的肺组织并分化为肺泡上皮细胞发挥治疗作用[14]。然而,由于细胞移植治疗的前期,BMSCs出现大量的死亡,限制了BMSCs在临床治疗组织损伤的能力。提高BMSCs抵御外界微环境变化的能力是十分必要的,因此本实验使用Lv-Nrf2转染BMSCs具有一定的可行性。
Nrf2具有调控细胞氧化还原环境的作用,是重要的抗氧化因子[15]。当细胞内环境改变时,Nrf2与抗氧化反应元件结合,启动抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达,提高细胞对外界有害环境的抵御能力。在呼吸机相关肺损伤小鼠模型中,与Nrf2+/+小鼠相比,Nrf2-/-小鼠氧化-抗氧化平衡破坏[16],小鼠的病死率显著增加。笔者以往实验结果也证实,姜黄素、沙利度胺等物质可通过激活Nrf2-ARE信号通路显著降低PQ诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞及急性中毒大鼠的病死率[9, 17],而在敲除Nrf2基因情况下,环木菠萝烯醇阿魏酸酯对PQ致HK-2细胞损伤的保护作用大大减低[3],说明PQ中毒与Nrf2基因有重要的联系。
MDA、CAT是机体内重要的氧化/抗氧化指标[18],其含量的多少可间接反映细胞内的氧化应激水平。本研究发现,PQ可直接导致BMSCs的内环境稳态失衡,细胞上清液中MDA含量明显升高,抗氧化因子CAT 活力降低;而Nrf2基因过表达可明显抑制PQ对BMSCs的损伤,说明Nrf2可抑制BMSCs的氧化应激损伤,进而降低细胞的病死率。Nrf2基因过表达抑制PQ对BMSCs损伤作用的机制还可能与Nrf2-ARE通路负调控NF-κB炎症通路有关,Nrf2基因过表达可导致NF-κB下游促炎症因子的表达下降[4, 19, 20],进而对细胞起保护作用。
线粒体途径是细胞凋亡的主要途径之一。实验研究发现Nrf2上游抑制因子Keap-1可与凋亡相关蛋白Bcl-2发生结合,激活caspase蛋白家族诱导细胞凋亡,而Nrf2基因上调可明显抑制Keap-1和Bal-2的结合,促进细胞稳定及细胞生存[21]。PQ中毒之后机体内有大量的活性氧蓄积,导致线粒体膜发生脂质过氧化,最终导致BMSCs凋亡,而Nrf2基因过表达可显著抑制PQ对BMSCs的促凋亡作用,表现为BMSCs的凋亡率明显下降,这可能与Nrf2及其下游蛋白转录增加从而抑制caspase蛋白家族的表达,进一步阻断细胞线粒体凋亡途径相关。
综上所述,Nrf2是细胞内抗氧化、抗凋亡、抗炎症通路的关键因子,其表达上调可明显抑制BMSCs的氧化应激损害及凋亡,显著提高BMSCs抵抗外界微环境变化的能力,从而为BMSCs治疗PQ导致的肺损伤的临床应用提供了理论依据。
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