中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (8): 834-838
右美托咪定对脓毒症大鼠炎症介质的影响
李欣, 李景辉 , 苏醒, 李英, 侯宇, 邓超    
570208 海口,中南大学湘雅医学院附属海口医院重症医学科
摘要目的 :观察右美托咪定对脓毒症大鼠不同时期炎症介质的作用及其对生存率的影响。 方法 将90只雄性Wistar大鼠随机(随机数字法)分为三组:正常对照组(C组),脓毒症模型组(S组),右美托咪定治疗组(D组)。正常对照组静脉注射等量的生理盐水,其余两组通过静注内毒素构建脓毒症模型,并给予相应不同的处理,按时间点取血,观察造模48 h内各组大鼠的行为改变和病死率;应用酶联免疫吸附法检测血液中的早期炎症介质肿瘤坏死因子-α、白介素-6和晚期炎症介质高迁移率族蛋白B1的含量变化。 结果 三组间大鼠病死率存在显著差别,肿瘤坏死因子α、白介素6、高迁移率族蛋白B1血清水平存在显著差异。 结论 右美托咪定对脓毒症大鼠早期和晚期炎症介质均有明显的抗炎作用,并可降低脓毒症大鼠病死率。
关键词右美托咪定     脓毒症     炎症介质     高迁移率族蛋白B1    
Effect of dexmedetomidine on inflammatory mediators in different periods of sepsis in rats
Li Xin, Li Jinghui , Su Xing, Li Ying, Hou Yu, Deng Chao    
Haikou Municipal People’s Hospital,Haikou 570208, China
Corresponding author: Li Jinghui, Email: shuo7076@163.com
Abstract: Objective To investigate the effect of dexmedetomidine (DEX) on inflammatory mediators in different periods of sepsis and its impact on survival rate of rats with sepsis. Methods Ninety male Wistar rats were randomly divided into three groups: control group (group C), sepsis model group (group S), and DEX treatment group (group D). Lipopolysaccharide (LPS) was injected to the vein to reproduce a classic sepsis model,while in control group, equivalent volume of NS was used instead. Different treatments were given to the corresponding groups, and then venous blood was taken at given intervals. Behavioral changes and mortality rate of rats within 48 hours after experiment were recorded. The levels of the early inflammatory mediators such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and the late inflammatory mediators such as high-mobility group boxl protein (HMGB1) in blood serum were detected by ELISA. Results Among three groups, there were significant differences in mortality rate of rats, the serum level of TNF-α, IL-6 and HMGB1 (all P < 0.05). Conclusion DEX has a certain anti-inflammatory effects on early and late stages of sepsis in rats with sepsis, and can also reduce the mortality rate.
Key words: Dexmedetomidine     Sepsis     Inflammatory mediators     High-mobility group boxl protein    

脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身性炎症综合征(SIRS),重者可发展为感染性休克、多器官功能衰竭[1] 。脓毒症是ICU患者最重要的死亡原因,但缺乏有效的治疗方法[2] 。镇静药物常用作ICU脓毒症重症患者的治疗,作用受到肯定。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂[3] ,不仅能有效镇静,且对脓毒症有抗炎作用[4] 。本实验研究右美托咪定能否降低脓毒症大鼠的病死率,及其对不同时期炎症介质的作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂

90只(12±1)周龄雄性Wistar大鼠,体质量(320±30) g,清洁级,购自湖南省长沙市东创实验动物科技服务部,许可证号:SCXK(湘)2009-0012。内毒素(脂多糖,Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5,LPS),购自美国SIGMA;盐酸右美托咪定注射液(DEX)购自江苏恒瑞;生理盐水注射液(0.9%氯化钠NS)购自四川科伦;大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒购自美国RD(沃宏);大鼠白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒购自美国RD(沃宏);大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)ELISA试剂盒购自美国RD(沃宏)。

1.2 大鼠模型制作及分组处理

将90只Wistar大鼠按体质量排序,随机(随机数字法)分为三组,每组30只。大鼠以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(350 mg/kg)后,给予股静脉置管。采用内毒素中毒的方法建立脓毒症模型,于股静脉置管处缓慢推注致死剂量的LPS(5 mg/kg)[5] ,建模后动物的病死率和促炎细胞因子(如TNF-α水平)是判定脓毒症严重程度的重要指标。

分组:(1)正常对照组(C组),注射等量生理盐水(NS)建立空白对照模型,建模成功后立即静脉泵注NS(1.0 mL/kg)10 min,再持续泵入NS 1.0 mL/( kg·h);(2)脓毒症模型组(S组),注射LPS建立脓毒症模型,建模成功后立即静脉泵注NS(1.0 mL/kg)10 min,再持续泵入NS 1.0 mL/( kg·h);(3)右美托咪定治疗组(D组),注射LPS建立脓毒症模型,建模成功后立即静脉泵注负荷剂量右美托咪定(DEX)(6.5 μg/kg) 10 min,再持续泵入维持剂量右美托咪定[5 μg/( kg·h)][6] 。各组均持续输注48 h,过程中大鼠单独饲养,给予正常饮食及活动空间。

实验过程中分别于造模前(LPS注射前)、造模后第1、3、6、9、12、24、36、48 小时采尾静脉血0.5 mL,离心取上清,标记好存于-80 ℃冰箱待检。注意每次取血后静脉补充等量NS。观察大鼠造模后48 h内的生理状况和生存情况,并统计其生存率,余下存活者采用脊椎脱臼法处死。

1.3 检测指标

采用ELISA试剂盒(RD公司)检测TNF-α、IL-6、HMGB1血清水平,严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。

1.4 统计学方法

所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s) 表示,均进行正态性检验及方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用重复测量数据的方差分析;采用Kaplan-Meier方法比较各组病死率。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠病死率

C组大鼠无死亡,S组大鼠死亡20只,D组死亡9只。S组注射LPS后1 h,实验大鼠运动状态明显减少,饮水欠佳;24~48 h时,大鼠被毛脏湿、眼睛周围的分泌物增多,身体抖动、行动迟缓,拒绝饮水,大鼠的病死率为66.7%。D组大鼠的状态明显好于S组,病死率为30.0%。C组大鼠状态正常。三组间病死率比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。各组大鼠生存曲线见图 1

图 1 各组大鼠Kaplan-Meier生存曲线 Fig 1 Survival analysis of rats in each group
2.2 大鼠血清中TNF-α、IL-6含量

与C组比较,S组、D组从造模后开始各时间点血清TNF-α水平均升高,造模后约6 h达到高峰(P < 0.05);其中S组升高趋势较大,D组各时间点TNF-α水平较S组均明显下降,差异具有统计学意义(P < 0.05),见表 1图 2

表 1 各组大鼠不同时间点TNF-α、IL-6血清质量浓度(ng/L, x±s)Table 1 The serum level of TNF-α and IL-6 at different time points (ng/L, x±s)
时间 TNF-α IL-6
C组 S组 D组 C组 S组 D组
造模前 49.30±17.13 59.68±26.18 61.44±22.07 62.40±19.08 57.30±22.29 65.70±26.40
造模后1 h 42.09±14.35 a 181.83±48.40 129.17±23.27 b 82.70±18.44 128.96±45.06 98.84±35.50
造模后3 h 58.38±16.74 a 275.60±51.19 170.95±22.17 b 65.38±27.94 a 133.31±32.43 112.80±38.18
造模后6 h 44.09±22.61 a 337.28±56.71 218.08±11.52 b 84.11±17.30 a 190.92±67.47 130.20±24.25 b
造模后9 h 55.43±22.88 a 225.51±40.12 156.50±10.33 b 86.03±35.75 a 233.59±72.14 170.10±57.96 b
造模后12 h 58.89±27.01 a 186.33±44.98 142.04±23.61 b 78.88±30.99 a 393.74±127.06 250.79±34.54 b
造模后24 h 54.06±24.44 a 176.11±54.32 101.17±5.30 b 88.07±22.09 a 203.45±78.79 142.08±39.14 b
造模后36 h 57.68±9.53 a 164.33±58.88 118.60±23.10 b 85.43±25.81 a 168.50±52.75 138.20±45.28
造模后48 h 60.66±27.08 a 157.04±34.47 122.89±20.86 69.88±27.28 a 137.34±49.91 106.53±32.44 b
注:与S组和D组比较, a P<0.05;与S组比较, b P<0.05
图 2 各组大鼠不同时间点血清TNF-α、IL-6含量变化 Fig 2 Comparison of the serum level of TNF-α and IL-6 among groups

与C组比较,S组、D组从造模后开始各时间点血清IL-6水平随时间延长逐渐升高,造模后约12 h达到高峰,差异具有统计学意义(P < 0.05);其中S组升高趋势较大,D组除造模后36 h时间点外的IL-6数值较S组均下降,且整体升高幅度较S组明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05),见表 1图 2

2.3 大鼠血清中HMGB1含量

与C组比较,S组、D组从造模后开始血清HMGB1水平随时间延长在造模后约6 h开始逐渐升高,36~48 h时达到高峰(P < 0.05);其中S组升高趋势较大,D组相应时间点血清HMGB1含量较S组下降(P < 0.05)。见表 2图 3

表 2 各组不同时间点HMGB1血清水平(ng/mL, x±s)Table 2 The serum level of HMGB1 at different time points among groups(ng/mL, x±s)
时间 C组 S组 D组
造模前 20.67±4.43 23.70±10.04 20.63±7.69
造模后1 h 20.56±9.16 24.02±12.00 22.79±9.52
造模后3 h 18.13±8.87 25.57±12.32 22.10±8.11
造模后6 h 18.31±9.63 32.38±15.43 20.18±9.61 b
造模后9 h 21.12±10.09 34.86±18.26 23.47±11.06
造模后12 h 20.92±6.46 a 47.26±23.26 35.32±18.72 b
造模后24 h 23.36±10.34 a 71.88±30.49 41.66±19.67 b
造模后36 h 20.63±7.68 a 86.28±42.46 58.94±27.58 b
造模后48 h 21.05±3.38 a 73.37±28.19 55.46±28.37 b
注:与S组和D组比较, a P<0.05;与S组比较, b P<0.05
图 3 各组大鼠不同时间点血清HMGB1含量变化 Fig 3 Comparison of the serum level of HMGB1 at different time points
3 讨论

在脓毒症的病理生理过程中,炎症介质是其内在关键性物质,它们使得整个疾病进展中贯穿着代偿与失衡,单次冲击与多重冲击等多种机制[7- 8] 。其中TNF-α由单核/巨噬细胞激活后产生[9] ,是脓毒症发展过程中最早出现的促炎因子之一。它通过炎症因子交互机制的活化启动全身炎症反应,引发不可控的瀑布式炎性反应[10] 。IL-6则是二级炎性反应介质的主要组成部分,通过测定IL-6的含量可以反映脓毒症的严重程度和预后情况[10, 11] 。阻滞IL-6可以提高CLP致脓毒症鼠模型的存活率[12]。高迁移率族蛋白B1 (high- mobility group boxl protein,HMGB1)作为一种关键的晚期炎症因子,在早期炎性介质作用减弱后参与全身炎性反应,发挥重要作用[13] ;且高峰持续时间较长,具有较宽泛的“治疗窗”,成为目前在临床上可能应用的重要治疗靶点[14] ,具有一定的临床干预价值。同时对HMGBl血清水平进行检测可能会成为一个新的临床检验方法,用以确定脓毒症患者病情轻重并预测其临床发展状况[15]

选择一种安全、有效的药物治疗脓毒症是当前国际上急需解决的重点和难点。DEX是一种新型的高选择性受体激动剂,它对位于脑和脊髓的α2肾上腺素能受体(α2-adrenergic receptors,α2-AR)产生激动效应,从而抑制交感神经的活动,并进一步产生镇静、镇痛、抗焦虑等多种功效[16] 。在许多临床观察中可以见到,DEX对脓毒症患者有一定的免疫调节作用,可能对脓毒症患者的康复有益[17] 。相关研究表明,DEX在临床应用剂量内,可抑制炎症反应,阻断其级联反应,具有明显的抗炎作用[6, 18]。Hofer等[19] 和Koca等[20] 也证实了DEX在实验性脓毒症小鼠中的作用,即在CLP所致的脓毒症小鼠模型中,应用DEX后发现炎性因子如TNF-α和IL-1β表达下降,提高了脓毒症小鼠的存活率。在本次实验中,D组大鼠较S组大鼠生存率明显升高,且差异具有统计学意义,表明应用DEX可以提高脓毒症大鼠的生存率。

在实验中笔者观察到,S组大鼠各时间点血清TNF-α的含量较C组显著增加,提示细胞因子的释放在大鼠脓毒症中起重要作用。同时,D组大鼠血清TNF-α的含量较S组降低,但仍高于C组,提示应用DEX后能降低血清中TNF-α的含量,表明DEX可抑制早期炎性细胞因子TNF-α的释放,具有早期抗炎作用。这与文献[10, 21]报道是一致的。同时,本实验结果显示,S组大鼠注射LPS后血清TNF-α水平早期即上升,且呈持续升高趋势,在第一个峰值出现后,呈现逐步缓慢下降,并维持在较高水平,最终造成全身各个脏器损伤,而后出现多器官功能衰竭。而D组各时间点TNF-α含量均较S组低,最终血清TNF-α维持水平也较其下降。

本实验还显示,注射LPS后约12 h IL-6升高最为显著,随后逐渐下降。在本实验中,笔者观察到,S组和D组大鼠造模后3 h开始各时间点血清IL-6的含量均较C组增加,同时与S组相比,D组大鼠多个时间点血清IL-6的水平明显降低,提示大鼠脓毒症时血清中细胞因子升高,应用DEX后能降低血清中IL-6的含量,表明DEX可抑制IL-6等相关炎性细胞因子释放。由曲线图可见,D组IL-6水平峰值较S组显著降低,但随时间点下降的速度较慢,其原因可能跟DEX可直接抑制部分IL-6产生和释放有关,而另一部分IL-6生成的减少则是通过减少TNF-α等因素来间接实现的。

在本实验中,笔者研究了DEX对LPS模型的脓毒症大鼠血清HMGB1水平的影响,注射LPS后S组6、12、24、36、48 h血清HMGB1水平均较C组显著升高,D组大鼠相应时间点血清HMGB1的含量较S组降低。结果显示,大鼠脓毒症晚期血清中有大量HMGB1,应用DEX处理后能降低HMGB1的血清水平,提示DEX可抑制晚期炎症因子HMGB1的活化和释放,但其具体作用机制有待进一步实验研究。

实验结果显示,正常大鼠血清炎症因子随时间没有明显变化,其余大鼠注射LPS后产生全身脓毒症,导致全身炎症因子的血清含量明显升高。与S组相比,D组血清TNF-α、IL-6水平和HMGB1含量明显下降,且病死率降低。DEX抑制了LPS刺激所致早期炎症因子TNF-α、IL-6和晚期炎症因子HMGB1血清水平的升高,提示DEX有明确的抗炎作用,在脓毒症大鼠发挥一定积极作用,维持机体炎症反应的平衡,提高脓毒症大鼠的生存率。DEX治疗脓毒症能够明显抑制血清TNF-α、IL-6和HMGB1的产生和释放而发挥抗炎作用,维持生理状态相对稳定,可能对临床脓毒症等炎症性疾病具有治疗作用。

参考文献
[1] Cadirci E, Altunkaynak BZ, Halici Z, et al. Alpha-lipoic acid as a potential target for the treatment of lung injury caused by cecal ligation and puncture-induced sepsis model in rats [J]. Shock,2010,33(5):479-484.
[2] Bernard AM, Bernard GR. The immune response: targets for the treatment of severe sepsis [J]. Int J Inflam,2012,2012:697592.
[3] Ozaki M, Takeda J, Tanaka K, et al. Safety and efficacy of dexmedetomidine for long-term sedation in critically ill patients [J]. J Anesth,2014,28(1):38-50.
[4] Pandharipande PP, Sanders RD, Girard TD, et al. Effect of dexmedetomidine versus lorazepam on outcome in patients with sepsis: an a priori-designed analysis of the MENDS randomized controlled trial.[J]. Crit Care,2010,14(2):R38.
[5] Rosengarten B, Hecht M, Auch D, et al. Microcirculatory dysfunction in the brain precedes changes in evoked potentials in endotoxin-induced sepsis syndrome in rats.[J]. Cerebrovasc Dis,2007,23(2-3):140-147.
[6] Taniguchi T, Kurita A, Kobayashi K, et al. Dose- and time-related effects of dexmedetomidine on mortality and inflammatory responses to endotoxin-induced shock in rats [J]. J Anesth,2008,22(3):221-228.
[7] Calvano SE, Xiao W, Richards DR, et al. A network-based analysis of systemic inflammation in humans [J]. Nature,2005,437(7061):1032-1037.
[8] Chaudhry H, Zhou J, Zhong Y, et al. Role of cytokines as a double-edged sword in sepsis [J]. In Vivo,2013,27(6):669-684.
[9] Kothari N, Bogra J, Abbas H, et al. Tumor necrosis factor gene polymorphism results in high TNF level in sepsis and septic shock [J]. Cytokine,2013,61(2):676-681.
[10] Song R, Kim J, Yu D, et al. Kinetics of IL-6 and TNF-alpha changes in a canine model of sepsis induced by endotoxin [J]. Vet Immunol Immunopathol,2012,146(2):143-149.
[11] Shahkar L, Keshtkar A, Mirfazeli A, et al. The role of IL-6 for predicting neonatal sepsis: a systematic review and meta-analysis [J]. Iran J Pediatr,2011,21(4):411-417.
[12] Barkhausen T, Tschernig T, Rosenstiel P, et al. Selective blockade of interleukin-6 trans-signaling improves survival in a murine polymicrobial sepsis model[J].Crit Care Med, 2011, 39(6):1407-1413.
[13] Huang W, Tang Y, Li L. HMGB1, a potent proinflammatory cytokine in sepsis [J]. Cytokine,2010,51(2):119-126.
[14] Gentile LF, Moldawer LL. HMGB1 as a therapeutic target for sepsis: it's all in the timing![J]. Expert Opin Ther Targets,2014,18(3):243-245.
[15] Diener KR, Al-Dasooqi N, Lousberg EL, et al. The multifunctional alarmin HMGB1 with roles in the pathophysiology of sepsis and cancer [J]. Immunol Cell Biol,2013,91(7):443-450.
[16] Carollo DS, Nossaman BD, Ramadhyani U. Dexmedetomidine: a review of clinical applications [J]. Curr Opin Anaesthesiol,2008,21(4):457-461.
[17] 张昌锋, 吴秀娟, 蒋宗明,等. 右美托咪定镇静对机械通气脓毒症休克患者细胞免疫和炎性因子的影响[J]. 河北医科大学学报,2013:33-36.
[18] Memis D, Hekimoglu S, Vatan I, et al. Effects of midazolam and dexmedetomidine on inflammatory responses and gastric intramucosal pH to sepsis, in critically ill patients [J]. Br J Anaesth,2007,98(4):550-552.
[19] Hofer S, Steppan J, Wagner T, et al. Central sympatholytics prolong survival in experimental sepsis [J]. Crit Care,2009,13(1):R11.
[20] Koca U, Olguner CG, Ergur BU, et al. The effects of dexmedetomidine on secondary acute lung and kidney injuries in the rat model of intra-abdominal sepsis [J]. ScientificWorldJournal,2013,2013:292687.
[21] Xu L, Bao H, Si Y, et al. Effects of dexmedetomidine on early and late cytokines during polymicrobial sepsis in mice[J]. Inflamm Res,2013,62(5):507-514.