脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身性炎症综合征(SIRS),重者可发展为感染性休克、多器官功能衰竭[1] 。脓毒症是ICU患者最重要的死亡原因,但缺乏有效的治疗方法[2] 。镇静药物常用作ICU脓毒症重症患者的治疗,作用受到肯定。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂[3] ,不仅能有效镇静,且对脓毒症有抗炎作用[4] 。本实验研究右美托咪定能否降低脓毒症大鼠的病死率,及其对不同时期炎症介质的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂90只(12±1)周龄雄性Wistar大鼠,体质量(320±30) g,清洁级,购自湖南省长沙市东创实验动物科技服务部,许可证号:SCXK(湘)2009-0012。内毒素(脂多糖,Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5,LPS),购自美国SIGMA;盐酸右美托咪定注射液(DEX)购自江苏恒瑞;生理盐水注射液(0.9%氯化钠NS)购自四川科伦;大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒购自美国RD(沃宏);大鼠白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒购自美国RD(沃宏);大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)ELISA试剂盒购自美国RD(沃宏)。
1.2 大鼠模型制作及分组处理将90只Wistar大鼠按体质量排序,随机(随机数字法)分为三组,每组30只。大鼠以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(350 mg/kg)后,给予股静脉置管。采用内毒素中毒的方法建立脓毒症模型,于股静脉置管处缓慢推注致死剂量的LPS(5 mg/kg)[5] ,建模后动物的病死率和促炎细胞因子(如TNF-α水平)是判定脓毒症严重程度的重要指标。
分组:(1)正常对照组(C组),注射等量生理盐水(NS)建立空白对照模型,建模成功后立即静脉泵注NS(1.0 mL/kg)10 min,再持续泵入NS 1.0 mL/( kg·h);(2)脓毒症模型组(S组),注射LPS建立脓毒症模型,建模成功后立即静脉泵注NS(1.0 mL/kg)10 min,再持续泵入NS 1.0 mL/( kg·h);(3)右美托咪定治疗组(D组),注射LPS建立脓毒症模型,建模成功后立即静脉泵注负荷剂量右美托咪定(DEX)(6.5 μg/kg) 10 min,再持续泵入维持剂量右美托咪定[5 μg/( kg·h)][6] 。各组均持续输注48 h,过程中大鼠单独饲养,给予正常饮食及活动空间。
实验过程中分别于造模前(LPS注射前)、造模后第1、3、6、9、12、24、36、48 小时采尾静脉血0.5 mL,离心取上清,标记好存于-80 ℃冰箱待检。注意每次取血后静脉补充等量NS。观察大鼠造模后48 h内的生理状况和生存情况,并统计其生存率,余下存活者采用脊椎脱臼法处死。
1.3 检测指标采用ELISA试剂盒(RD公司)检测TNF-α、IL-6、HMGB1血清水平,严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。
1.4 统计学方法所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s) 表示,均进行正态性检验及方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用重复测量数据的方差分析;采用Kaplan-Meier方法比较各组病死率。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠病死率C组大鼠无死亡,S组大鼠死亡20只,D组死亡9只。S组注射LPS后1 h,实验大鼠运动状态明显减少,饮水欠佳;24~48 h时,大鼠被毛脏湿、眼睛周围的分泌物增多,身体抖动、行动迟缓,拒绝饮水,大鼠的病死率为66.7%。D组大鼠的状态明显好于S组,病死率为30.0%。C组大鼠状态正常。三组间病死率比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。各组大鼠生存曲线见图 1。
2.2 大鼠血清中TNF-α、IL-6含量与C组比较,S组、D组从造模后开始各时间点血清TNF-α水平均升高,造模后约6 h达到高峰(P < 0.05);其中S组升高趋势较大,D组各时间点TNF-α水平较S组均明显下降,差异具有统计学意义(P < 0.05),见表 1、图 2。
时间 | TNF-α | IL-6 | |||||
C组 | S组 | D组 | C组 | S组 | D组 | ||
造模前 | 49.30±17.13 | 59.68±26.18 | 61.44±22.07 | 62.40±19.08 | 57.30±22.29 | 65.70±26.40 | |
造模后1 h | 42.09±14.35 a | 181.83±48.40 | 129.17±23.27 b | 82.70±18.44 | 128.96±45.06 | 98.84±35.50 | |
造模后3 h | 58.38±16.74 a | 275.60±51.19 | 170.95±22.17 b | 65.38±27.94 a | 133.31±32.43 | 112.80±38.18 | |
造模后6 h | 44.09±22.61 a | 337.28±56.71 | 218.08±11.52 b | 84.11±17.30 a | 190.92±67.47 | 130.20±24.25 b | |
造模后9 h | 55.43±22.88 a | 225.51±40.12 | 156.50±10.33 b | 86.03±35.75 a | 233.59±72.14 | 170.10±57.96 b | |
造模后12 h | 58.89±27.01 a | 186.33±44.98 | 142.04±23.61 b | 78.88±30.99 a | 393.74±127.06 | 250.79±34.54 b | |
造模后24 h | 54.06±24.44 a | 176.11±54.32 | 101.17±5.30 b | 88.07±22.09 a | 203.45±78.79 | 142.08±39.14 b | |
造模后36 h | 57.68±9.53 a | 164.33±58.88 | 118.60±23.10 b | 85.43±25.81 a | 168.50±52.75 | 138.20±45.28 | |
造模后48 h | 60.66±27.08 a | 157.04±34.47 | 122.89±20.86 | 69.88±27.28 a | 137.34±49.91 | 106.53±32.44 b | |
注:与S组和D组比较, a P<0.05;与S组比较, b P<0.05 |
与C组比较,S组、D组从造模后开始各时间点血清IL-6水平随时间延长逐渐升高,造模后约12 h达到高峰,差异具有统计学意义(P < 0.05);其中S组升高趋势较大,D组除造模后36 h时间点外的IL-6数值较S组均下降,且整体升高幅度较S组明显降低,差异具有统计学意义(P < 0.05),见表 1、图 2。
2.3 大鼠血清中HMGB1含量与C组比较,S组、D组从造模后开始血清HMGB1水平随时间延长在造模后约6 h开始逐渐升高,36~48 h时达到高峰(P < 0.05);其中S组升高趋势较大,D组相应时间点血清HMGB1含量较S组下降(P < 0.05)。见表 2、图 3。
时间 | C组 | S组 | D组 |
造模前 | 20.67±4.43 | 23.70±10.04 | 20.63±7.69 |
造模后1 h | 20.56±9.16 | 24.02±12.00 | 22.79±9.52 |
造模后3 h | 18.13±8.87 | 25.57±12.32 | 22.10±8.11 |
造模后6 h | 18.31±9.63 | 32.38±15.43 | 20.18±9.61 b |
造模后9 h | 21.12±10.09 | 34.86±18.26 | 23.47±11.06 |
造模后12 h | 20.92±6.46 a | 47.26±23.26 | 35.32±18.72 b |
造模后24 h | 23.36±10.34 a | 71.88±30.49 | 41.66±19.67 b |
造模后36 h | 20.63±7.68 a | 86.28±42.46 | 58.94±27.58 b |
造模后48 h | 21.05±3.38 a | 73.37±28.19 | 55.46±28.37 b |
注:与S组和D组比较, a P<0.05;与S组比较, b P<0.05 |
在脓毒症的病理生理过程中,炎症介质是其内在关键性物质,它们使得整个疾病进展中贯穿着代偿与失衡,单次冲击与多重冲击等多种机制[7- 8] 。其中TNF-α由单核/巨噬细胞激活后产生[9] ,是脓毒症发展过程中最早出现的促炎因子之一。它通过炎症因子交互机制的活化启动全身炎症反应,引发不可控的瀑布式炎性反应[10] 。IL-6则是二级炎性反应介质的主要组成部分,通过测定IL-6的含量可以反映脓毒症的严重程度和预后情况[10, 11] 。阻滞IL-6可以提高CLP致脓毒症鼠模型的存活率[12]。高迁移率族蛋白B1 (high- mobility group boxl protein,HMGB1)作为一种关键的晚期炎症因子,在早期炎性介质作用减弱后参与全身炎性反应,发挥重要作用[13] ;且高峰持续时间较长,具有较宽泛的“治疗窗”,成为目前在临床上可能应用的重要治疗靶点[14] ,具有一定的临床干预价值。同时对HMGBl血清水平进行检测可能会成为一个新的临床检验方法,用以确定脓毒症患者病情轻重并预测其临床发展状况[15] 。
选择一种安全、有效的药物治疗脓毒症是当前国际上急需解决的重点和难点。DEX是一种新型的高选择性受体激动剂,它对位于脑和脊髓的α2肾上腺素能受体(α2-adrenergic receptors,α2-AR)产生激动效应,从而抑制交感神经的活动,并进一步产生镇静、镇痛、抗焦虑等多种功效[16] 。在许多临床观察中可以见到,DEX对脓毒症患者有一定的免疫调节作用,可能对脓毒症患者的康复有益[17] 。相关研究表明,DEX在临床应用剂量内,可抑制炎症反应,阻断其级联反应,具有明显的抗炎作用[6, 18]。Hofer等[19] 和Koca等[20] 也证实了DEX在实验性脓毒症小鼠中的作用,即在CLP所致的脓毒症小鼠模型中,应用DEX后发现炎性因子如TNF-α和IL-1β表达下降,提高了脓毒症小鼠的存活率。在本次实验中,D组大鼠较S组大鼠生存率明显升高,且差异具有统计学意义,表明应用DEX可以提高脓毒症大鼠的生存率。
在实验中笔者观察到,S组大鼠各时间点血清TNF-α的含量较C组显著增加,提示细胞因子的释放在大鼠脓毒症中起重要作用。同时,D组大鼠血清TNF-α的含量较S组降低,但仍高于C组,提示应用DEX后能降低血清中TNF-α的含量,表明DEX可抑制早期炎性细胞因子TNF-α的释放,具有早期抗炎作用。这与文献[10, 21]报道是一致的。同时,本实验结果显示,S组大鼠注射LPS后血清TNF-α水平早期即上升,且呈持续升高趋势,在第一个峰值出现后,呈现逐步缓慢下降,并维持在较高水平,最终造成全身各个脏器损伤,而后出现多器官功能衰竭。而D组各时间点TNF-α含量均较S组低,最终血清TNF-α维持水平也较其下降。
本实验还显示,注射LPS后约12 h IL-6升高最为显著,随后逐渐下降。在本实验中,笔者观察到,S组和D组大鼠造模后3 h开始各时间点血清IL-6的含量均较C组增加,同时与S组相比,D组大鼠多个时间点血清IL-6的水平明显降低,提示大鼠脓毒症时血清中细胞因子升高,应用DEX后能降低血清中IL-6的含量,表明DEX可抑制IL-6等相关炎性细胞因子释放。由曲线图可见,D组IL-6水平峰值较S组显著降低,但随时间点下降的速度较慢,其原因可能跟DEX可直接抑制部分IL-6产生和释放有关,而另一部分IL-6生成的减少则是通过减少TNF-α等因素来间接实现的。
在本实验中,笔者研究了DEX对LPS模型的脓毒症大鼠血清HMGB1水平的影响,注射LPS后S组6、12、24、36、48 h血清HMGB1水平均较C组显著升高,D组大鼠相应时间点血清HMGB1的含量较S组降低。结果显示,大鼠脓毒症晚期血清中有大量HMGB1,应用DEX处理后能降低HMGB1的血清水平,提示DEX可抑制晚期炎症因子HMGB1的活化和释放,但其具体作用机制有待进一步实验研究。
实验结果显示,正常大鼠血清炎症因子随时间没有明显变化,其余大鼠注射LPS后产生全身脓毒症,导致全身炎症因子的血清含量明显升高。与S组相比,D组血清TNF-α、IL-6水平和HMGB1含量明显下降,且病死率降低。DEX抑制了LPS刺激所致早期炎症因子TNF-α、IL-6和晚期炎症因子HMGB1血清水平的升高,提示DEX有明确的抗炎作用,在脓毒症大鼠发挥一定积极作用,维持机体炎症反应的平衡,提高脓毒症大鼠的生存率。DEX治疗脓毒症能够明显抑制血清TNF-α、IL-6和HMGB1的产生和释放而发挥抗炎作用,维持生理状态相对稳定,可能对临床脓毒症等炎症性疾病具有治疗作用。
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