严重感染及其相关的感染性休克和多脏器功能障碍综合征是当前重症监护病房的主要的死亡原因之一^[1]。脓毒症导致的多脏器功能障碍综合征中肺损伤往往最早出现，常常加速其他器官的功能障碍。血管内皮屏障功能障碍是脓毒症的重要病理生理表现，其重要发生机制之一为细胞内环磷酸腺苷(cAMP)降低，导致内皮细胞骨架和细胞间连接破坏^[2]。多药耐药相关蛋白4(MRP4)可利用三磷酸腺苷水解的能量逆浓度梯度主动转出细胞内cAMP，对细胞内cAMP水平具有重要调节作用^[3]。因此，MRP4可能在脓毒症时血管内皮屏障功能障碍发生发展中具有重要作用，然而目前国内外尚未见相关研究报道。本研究在脓毒症大鼠动物模型上研究发现抑制MRP4可显著改善脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能障碍。因此，MRP4是可能有效防治脓毒症时血管内皮屏障功能障碍的新靶点。

实验使用雄性SD大鼠，清洁级，体质量220~280 g，由武汉大学实验动物中心提供。60只大鼠随机(随机数字法)分为假手术组、脓毒症组和MRP4抑制剂干预组，每组20只动物。假手术组仅接受盲肠探查术。脓毒症组行盲肠结扎穿刺术。MRP4抑制剂干预组行盲肠结扎穿孔术，并于术前30 min腹腔注射MRP4抑制剂MK571(20 mg/kg)(Cayman Chemical Company，USA)。假手术组和脓毒症组术前30 min腹腔注射等量生理盐水。

通过盲肠结扎穿孔建立大鼠脓毒症模型。2%戊巴比妥钠(80 mg/kg)腹腔麻醉后沿腹正中线作2 cm切口，暴露盲肠，将粪便轻轻挤向盲肠盲端，丝线结扎盲肠于靠回盲部1/2处，用18G针头由系膜端向对侧穿通盲肠2次，避开血管，并挤出适量粪便，其后将盲肠放回腹腔，逐层缝合腹部切口，术毕动物皮下注射林格液，补充手术过程中体液的丢失，剂量为3 mL/100 g。

于术后24 h抽取大鼠尾静脉血1 mL，静置15 min，1 500 r/min离心20 min，采集血清，-20 ℃保存。用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)检测血清白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

术后24 h麻醉大鼠后取右肺中叶肺组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片(5 μm)，进行苏木精-伊红(HE)染色，普通光镜下观察肺组织的肺泡充血、水肿及炎症细胞浸润情况。

术后24 h麻醉大鼠后经左侧股静脉注射1%伊文思蓝液(EBD)(美国Amresco公司)2 mL/kg体质量，30 min后迅速行气管插管机械通气并经颈动脉放血处死大鼠，立即开胸剪开左心房，将连接输液装置的9号注射针头插入肺动脉圆锥，在2.94 kPa下用生理盐水灌流肺血管至左心房处为清亮液体为止。取部分右肺中叶(约100 mg)，吸干表面水分及血液，称湿质量，将肺组织剪成约10 mm 3 小块浸泡于甲酰胺(美国Amresco公司)溶液中(每100 mg肺组织3 mL甲酰胺)，置60 ℃恒温水浴中抽提24 h，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，在与标准曲线相同的条件下，用酶标仪(美国Perkin Elmer公司)在630 nm波长处进行测定吸光度(A)值，在标准曲线上查出伊文思蓝含量，以每克肺组织中EBD含量反映肺血管通透性变化。

采用SPSS 19.0软件做统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s) 表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

假手术组大鼠肺大体观察呈粉红色，光镜下肺泡结构完整，肺泡腔清晰，肺间质无水肿，无白细胞浸润(图 1A)；脓毒症组大鼠大体观察肺表面暗红，包膜下点、片状出血，切面有黄色液体，光镜下肺泡结构不清晰，肺泡隔增宽，透明膜形成，肺泡内见白细胞渗出、出血，肺间质见大量炎症细胞浸润(图 1B)；MRP4抑制剂干预组较脓毒症组肺组织破坏和炎性细胞浸润显著减少(图 1C)。

A、B、C分别为假手术组、脓毒症组和MRP4抑制剂干预组 图 1 肺组织病理切片HE染色的代表性图片(×200) Fig 1 Representative optical microscopy images of lung tissue sections in the three groups(×200)

图选项

与假手术组大鼠相比，脓毒症组大鼠术后24 h血清IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)。与脓毒症大鼠组比较，MRP4抑制剂干预组大鼠血清IL-6和TNF-α水平明显降低(P<0.05)。见图 2。

与假手术组比较，aP<0.05；与脓毒症组比较，bP<0.05 图 2 大鼠血清IL-6和TNF-α水平的比较 Fig 2 Comparison of serum IL-6 level and TNF-α level in the groups

图选项

与假手术组大鼠相比，脓毒症组大鼠肺组织伊文思蓝含量显著增多，提示肺渗透性增强。与脓毒症大鼠组比较，MRP4抑制剂干预组大鼠肺组织伊文思蓝含量明显减少，提示肺渗透性降低。

临床上，脓毒症患者常出现进展性皮下和体腔水肿，提示血管渗透性的显著增加^[4]。研究证实，组织水肿并非良性：实质和间质液体的潴留可增加氧弥散距离，降低微血管灌注，进而削弱器官功能^[5]。脓毒症休克恢复过程的一个典型特征就是自发性利尿，伴随水肿减轻，与此同步对应的则是血管完整性的恢复。因此，针对血管屏障功能障碍是治疗是有效防治脓毒症时器官功能障碍的重要方面^[4]。

研究发现，cAMP是稳定血管内皮屏障最为重要的信号分子之一。既往研究已经表明，细胞内cAMP的减少是炎性屏障功能破坏的重要机制^{[6, 7]}。提高细胞内cAMP水平可以抑制炎症因子和感染所引起的内皮屏障功能破坏^{[8, 9]}。cAMP主要通过下游分子Rac1对血管内皮屏障发挥调节作用^[1]。Rac1是Rho 家族的GTP 酶成员之一，是屏障维持和稳定的主要分子。研究证实，激活Rac1 通过增加连接相关的微丝骨架稳定内皮屏障功能，其失活则促进了病理状态下微血管内皮屏障功能的破坏^{[10, 11, 12]}。促炎症细胞因子是脓毒症器官损伤主要的启动、扩大及维持介质。研究发现，脂多糖、TNF-α引起血管内皮渗透性增加主要是通过诱导Rac1失活产生，其机制均是cAMP依赖的^{[13, 14]}。目前认为炎性介质介导的内皮屏障功能破坏归因于细胞内cAMP 降低，进而诱导Rac 1失活，通过提高细胞内cAMP 的浓度来改善内皮屏障功能被认为是脓毒症治疗的新方向^{[9, 15]}。

MRP4，又称ABC转运蛋白家族4(ATP-binding cassette transporter family class C4，ABCC4)，是多药耐药蛋白大家族MRPs的一员。MRP4在肝脏、肾脏、脑、血管、上皮、平滑肌等多种组织存在高表达，主要参与转运细胞cAMP等内源性分子，调控细胞内的环核苷酸水平。研究发现，抑制MRP4 或基因沉默MRP4 可提高细胞内cAMP水平^{[16, 17, 18]}。MRP4 降低细胞内cAMP 水平的机制之一为刺激细胞内前列腺素释放，降低细胞内前列腺素聚集，促进细胞内cAMP 外流^[19]。研究显示，应用MRP4 抑制剂MK571可通过提高细胞内cAMP水平而有效阻止肺动脉高压、阿司匹林抵抗等疾病发生^[20]。Leite 等^[21]在酵母聚糖诱导的腹膜炎小鼠动物模型上研究发现，MRP4 抑制剂MK571 可显著降低血管渗透性、细胞迁移、组织水肿和炎性渗出。本实验采用经典的盲肠结扎穿刺来建立脓毒症大鼠动物模型，发现抑制MRP4可显著降低脓毒症大鼠血清促炎性因子水平，减轻肺组织损伤程度和炎性浸润，降低肺组织渗透性，提示抑制MRP4可显著改善脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能障碍。

本研究初步发现抑制MRP4可减轻脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能障碍，对临床脓毒症的防治具有一定的价值，未来可在以下方面进一步深入研究：脓毒症时肺组织MRP4表达的变化；不同浓度MRP4 抑制剂MK571的作用效果，明确最佳剂量；抑制MRP4改善脓毒症肺血管内皮屏障功能障碍的分子机制。

总之，本研究在脓毒症大鼠模型中发现抑制MRP4可以改善肺血管内皮屏障功能障碍，提示MRP4可能是防治脓毒症器官损伤的重要分子靶点。