中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (7): 768-771
百草枯大鼠肺组织炎症因子TNF-α和IL-6的表达和
谢宗贤, 徐兵 , 王繁麟, 朱健, 王进华    
基金项目:上海市奉贤区科学技术发展基金项目(奉科2012-1105)
作者单位:201411 上海,上海市奉贤区奉城医院急诊科(谢宗贤、王进华);
上海市交通大学附属九院急诊科(徐兵、王繁麟、朱健)

百草枯(paraquat,PQ),化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐,是一种快速灭生性除草剂。对人毒性极大,且无特效解毒药,目前已被20多个国家禁止或者严格限制使用。在我国使用、生产量大,使用不当或误服均可导致中毒,口服致死率高达60%~90%[1],大剂量口服患者短期内即可出现多脏器功能衰竭死亡,而度过急性期的患者往往死于肺纤维化[2]。百草枯中毒目前尚无统一的治疗标准,主要以对症支持治疗为主,临床上使用较多采取早期洗胃、活性炭吸附、血液置换(灌流)、抗氧化治疗等,但效果不佳[3]。有研究发现,百草枯进入人体后形成一系列的活性氧自由基,是后续炎症反应和纤维化的重要原因,其中TNF-α、IL-6是公认的炎性因子。Cyr61是一种富含半胱氨酸的基质蛋白,不仅在机体的胚胎发育、损伤修复中担任重要作用,近年来发现也参与炎症和自身免疫病,是新促炎因子[3] ,但是否参与百草枯介导的肺纤维化尚无报道。

目前,临床上采用抗氧化剂如维生素E、维生素C和还原性谷胱甘肽等药物治疗百草枯介导的肺纤维化的疗效均不理想,因此找到一种能早期有效阻断百草枯中毒产生的氧化损伤药物成为治疗百草枯中毒的关键[4]。早在上世纪90年代,就有学者提出水杨酸钠具有抗炎作用,水杨酸钠近年来被证实有抗氧化损伤的作用。为此,本实验通过观察百草枯染毒大鼠肺损伤模型及水杨酸钠干预后TNF-α、IL-6和Cyr61的基因及蛋白表达格局变化,以及光镜下观察肺纤维化程度,进一步评估水杨酸钠的干预效果。

1 材料与方法 1.1 动物分组与处理

18只8~10周龄清洁级雄性Wister大鼠,体质量250~300 g,由上海交通大学附属第九人民医院动物实验中心提供。随机(随机数字法)分为对照组(0.9%NaCl),PQ染毒组及NaSAL干预组(PQ+NaSAL),每组6只(在实验的第14、28天各检测3只)。对照组按0.005 mL/g给予生理盐水灌胃,2 h后腹腔 注射同等体积的生理盐水;PQ染毒组,每只大鼠按照体质量80 mg/kg百草枯一次性灌胃,2 h后,腹腔注射同等体积的生理盐水;NaSAL 干预组用同样剂量百草枯一次性灌胃染毒2 h后,腹腔注射NaSAL 120 mg/kg。染毒结束后按时间点处死动物,所有动物实验均在13:00至15:00完成。

1.2 组织标本采集

分别在染毒后第14、28天取对照组、PQ染毒组、 NaSAL干预组动物各3只,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,常规乙醇消毒,打开腹腔,腹主动脉采血行动脉血气分析后处死动物,剪下整个肺脏,观察大体情况,分成左右两肺,用灭菌的生理盐水冲洗3次,左肺固定于4%甲醛中1周,常规石蜡包埋,右肺组织研磨后取上清液检测TNF-α、IL-6和Cyr61表达。

1.3 肺部组织学检查

取固定的肺组织,常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、连续切片行HE染色,光镜下观察比较。

1.4 主要试剂

20%百草枯水剂(山东绿霸化工股份有限公司);大鼠TNF-α酶联免疫试剂盒(R&D公司);大鼠IL-6酶联免疫试剂盒 (R&D公司)。

1.5 实时定量PCR

采用ABI公司提供的软件Prism2.0设计所检测基因表达引物,序列见表 l。方法与结果分析同以前报道[4]。简述之:收集刺激后细胞,用TRIzon提取RNA,经oligo(dT)逆转录为cDNA后,将荧光染料SYBR Green分别和目的基因或内参GAPDH的引物混匀后,加入Real-time PCR检测板、密封、上机检测(ABI 7500)。所采用的反应条件为:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共40个循环。根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本目的基因相对表达量,采用Graphpad prism 5.0进行作图和分析。

表 1 Real-time PCR 检测基因和引物序列
基因名称 引物序列(5’-3’)
TNF-α 正向引物CTCCGGGCTCAGAATTTCC
反向引物CGCAATCCAGGCCACTACTT
IL-6 正向引物CCACCAGGAACGAAAGTCAAC
反向引物GGCAGTGGCTGTCAACAACA
Cyr61 正向引物CGGAACCTCGAGTCCTTTACAA
反向引物AGGACGTAGTCTGAACGATGCAT
GAPDH 正向引物GTGAAGGTGCGGAGTCAACG
反向引物TGAGGTCAATGAAGGGGTC
1.6 酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)检测组织TNF-α、IL-6蛋白含量

取右肺组织0.1 g,组织匀浆按照标准方法进行,取上清液,分装,-80 ℃保存,备用。建立标准曲线:设标准孔8孔,每孔各加入样品稀释液100 μL,第8孔为空白对照。加样:待测品孔中每孔各加入待测样品100 μL。洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤,每孔中加入第一抗体工作液50 μL。洗板:同前。每孔加酶标抗体工作液100 μL。洗板 :同前。每孔加入底物工作液100 μL,加入 50 μL终止液混匀。在492 nm处测吸光度值。所有吸光度值都减除空白值后再行计算。以标准品吸光度值,画出标准曲线。TNF-α,IL-6回归曲线分别为: y1 = 0.085+0.003x1y2 = 0.113+0.001x2,根据样品吸光度值可查出相应的 TNF-α和IL-6的蛋白量。

1.7 统计学方法

由Excel 2010录入数据,采用SPSS 18.0进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两两比较采用SNK- q 检验,组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 不同染毒时间节点各组大鼠动脉血气的变化

染毒组动脉血气中氧分压水平均降低,呈持续下降趋势,在28 d达到高峰,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);干预组氧分压水平较染毒组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。同表中可见,染毒组动脉血气分析中二氧化碳分压较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。可见在实验过程中干预组较染毒组大鼠肺通气-换气功能有所改善。见表 2

表 2 PQ染毒组、干预组和对照组动脉血气分析中PO2和PCO2水平(mmHg,x±s)
组 别血气氧分压血气二氧化碳分压
14 d28 d14 d28 d
对照组107.23±1.98102.7±4.7342.9±3.6142.4±2.31
染毒组91.8±3.43a90.6±2.2a55.5±2.16a67.3±1.75a
干预组103.5±1.02b105±4.0b44.0±1.68b60.7±1.68b
注:与对照组比较,aP<0.05;与染毒组比较,bP<0.05
2.2 不同染毒时间各组TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白含量的变化

本研究首先检测了各组肺组织中TNF-α和IL-6mRNA 表达格局。结果发现:14 d和28 d观察的染毒组肺组织中TNF-α和IL-6均明显增高(图 1P<0.01),这一结果与已有报道相符。但是使用水杨酸干预后均明显降低(图 1P<0.01)。提示水杨酸干预能够下调TNF-α和IL-6表达水平。

图 1 不同染毒时间各组TNF-α、IL-6 mRNA 表达

进一步采用ELISA法检测了肺组织匀浆上清液,染毒组肺脏样本中TNF-α蛋白表达均增强,第14 天达到峰值,染毒组各时段TNF-α蛋白水平与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);干预组TNF-α蛋白表达水平均低于染毒组(P<0.05),而与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。染毒组亦上调IL-6蛋白的表达,且表达水平呈上升趋势,染毒后第14天表达水平最高,第28天有下降,染毒组各时段IL-6蛋白表达水平与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。整个实验周期中,干预组各时段TNF-α、IL-6蛋白表达水平较对照组升高。对染毒组一次性注射NaSAL 120 mg/kg后,降低了TNF-α、IL-6蛋白水平,与染毒组比较,干预组肺组织 TNF-α、IL-6蛋白水平表达明显下降(P<0.05)。见表 3

表 3 PQ染毒组,NaSAL干预组及对照组肺组织中TNF-α、IL-6蛋白相对表达水平 (x±s)
时点TNF-αIL-6
对照组染毒组干预组对照组染毒组干预组
14 d0.55±0.071.63±0.21a0.77±0.13b0.15±0.030.48±0.03a0.21±0.02b
28 d0.53±0.061.20±0.26a0.64±0.05b0.16±0.040.43±0.01a0.19±0.02b
注:与对照组比较,aP<0.05;与染毒组比较,bP<0.05
2.3 HE染色光镜下病理表现

染毒组染毒后 14 d可见成纤维细胞增生,肺泡间隔增宽,少许胶原沉积及斑片状纤维化改变(图 2B);28d纤维化病变范围弥散,大量肺泡结构萎陷、破坏,大量胶原沉积,肺泡间隔以及部分肺泡腔被大量胶原和纤维蛋白占据,偶见部分残存代偿的肺泡腔过度膨胀。干预组各时点病理变化较染毒组相似,但程度较轻,14 d和28 d少量肺泡萎陷,可见胶原沉积,周围存在较多正常肺组织(图 2CD)。

A:正常组;B:染毒组;C:干预组14 d;D:干预组28 d 图 2 各组HE染色光镜下病理表现
3 讨论

百草枯中毒的主要靶器官是肺脏,中毒特征改变是急性肺损伤,主要是由于肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞早期的破坏和肺泡炎、肺水肿、炎症细胞浸润导致的,并最终引起的肺纤维化[5]。百草枯口服入血后,约有50%分布集中于肺组织,早期尤以弥漫性肺泡损伤最为突出。动物实验百草枯所致肺损伤的演变过程大概可分为染毒后1~7 d出现肺泡炎、肺水肿、肺出血;7~14 d左右水肿消减后修复机化;28 d以后明显纤维疤痕形成[6]。在实验的过程中,通过观察发现染毒后大鼠可出现体质量下降、呼吸急促、精神萎靡、脱毛等表现,与陆如风等报道相似。染毒组大鼠在染毒后2 h开始出现精神不佳,出现不同程度的毛发松散、眯眼、拱背、步态蹒跚,12 h后则出现口唇发绀、后肢无力、仰卧,并伴有呼吸加深加快等现象,2 h时出现反应迟钝、呼吸急促甚至呼吸窘迫等各种症状,部分大鼠出现血尿、眼球出血等现象[7]。在采集样本过程中,肉眼观察染毒组大鼠 14 d 肺脏呈部分灰白色,无明显肿胀,有斑点或斑片状实变灶形成;28 d 双肺苍白,肺弹性差、硬度增加。光镜下染毒组大鼠肺组织14 d 有肺泡炎存在,混合有出血及水肿,成纤维细胞增生,肺间隔明显增宽,胶原沉积及斑片状的纤维化改变;28 d 肺泡炎较前减轻,肺泡结构萎陷、破坏,大量胶原沉积在新生的毛细血管周围。说明百草枯中毒后肺损伤2周后出现肺纤维化,4周后明显。

近年来,人们逐渐把百草枯致肺纤维化机制从病变部位细胞成分的变化转移到由各种细胞释放的各种生物活性分子上来。氧化应激引起的炎症反应是目前较公认的PQ中毒机制,在Chen等[8]的研究发现了在百草枯染毒大鼠的肺组织 TGF-β1在肺损伤中发挥着重要作用。随后的研究中在早期肺损伤激活后通过一系列炎症细胞因子参与到肺部炎症的发展中,如TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6、IL-8及继发性炎症因子形成“细胞因子级联反应”启动肺部炎症,而且一旦启动就难以控制,形成放大效应,加速肺泡炎症发展和放大[4]

在本项研究发现,80 mg/kg百草枯染毒后TNF-α、IL-6蛋白含量升高,在第14天时达到高峰,在第28天的检测中有所下降,2个时间点与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。水杨酸钠干预后在各时点TNF-α、IL-6蛋白的表达水平均明显低于染毒组(P<0.05),表明TNF-α、IL-6的表达与肺损伤的程度呈正相关的,但就如何参与调控肺纤维的机制仍未有报道。

在14 d和28 d干预组 HE染色中发现成纤维细胞增殖、肺泡萎陷、胶原沉积的情况相对较轻,肺纤维化程度较染毒组轻,说明水杨酸钠能明显减轻肺炎性反应,降低肺组织中 TNF-α及IL-6水平,抑制了一系列炎症反应的程度。早期应用水杨酸钠可以减轻肺纤维化程度,提示水杨酸钠早期抗抗炎作用,这点在一些早期研究中也得到支持[9]

Cyr61是一种富含半胱氨酸的基质蛋白,近年来发现也参与炎症和自身免疫病,例如能促进类风关患者滑膜细胞增生和产生IL-6,IL-8等炎症因子,因此是新促炎因子[10, 11, 12]。但是本研究的初步结果中未发现染毒组肺组织中Cyr61表达变化(数据未显示),提示作为新促炎因子,Cyr61在百草枯诱导的肺组织损伤中的作用尚需进一步研究。

对百草中毒急救药物的探寻仍是临床上尚未解决的一道难题。水杨酸钠在其他疾病中的抗炎效果已得到了证实。本次实验中,水杨酸钠对百草枯所致肺损伤的保护作用也得到了初步论证。但对其是否能在临床上应用及推广还需作进一步的实验研究。

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