在颅脑损伤患者中，脑缺血和脑梗死是继发性损伤中最常见的病理改变，被称为外伤性血液动力学性血管麻痹性缺血灶，尤其在脑损伤的缺血半影区，脑组织缺血缺氧后氧造成了细胞线粒体能量代谢障碍，最终导致细胞程序性坏死，即细胞凋亡^[1]，因此改善组织的氧供被认为是治疗脑外伤的一项重要措施。近年来的大量的实验研究及临床研究及证实早期高压氧治疗脑外伤具有明显的疗效^[2]，但是由于高压氧治疗时间窗有限，许多患者在脑外伤早期病情不稳定或不能耐受高氧舱治疗，丧失最佳治疗时机。近年来研究表明常压高氧治疗能够保护神经功能，其优点是应用简单、非侵袭，尤其可以早期运用于临床^{[1, 3]}，但是常压高氧治疗保护神经功能机制尚未阐明，因此，本实验拟通过脑外伤模型，探讨早期常压高氧对脑外伤神经功能保护作用及其机制的研究。

健康雄性成年SD大鼠220只，体质量200~250 g。随机(随机数字法)分为4组：假手术组(Sham)、外伤模型组(Vehicle)、常压高氧组(HN)及高压氧组(HBO)；每组各分为八个亚组，神经功能缺损评分(n=10)、线粒体膜电位(MMP)检测(n=6)，线粒体电镜检测(n=3)，水迷宫实验(n=10)，脑血流量检测(n=10)，线粒体丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)检测(n=6)，TUNEL检测(n=6)和Caspase-3 蛋白检测(n=4)，大鼠均购自浙江省医学科学院实验动物中心。本研究实验动物的应用及实验程序得到浙江大学医学院实验动物应用管理委员会同意。

丙二醛(20130212)以及超氧化物歧化酶(20130225)测试盒购自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白定量试剂盒(KGPBCA)购自南京凯基生物技术有限公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(NO.4810-30-K)购自Trevigen生物技术有限公司，线粒体膜电位测定试剂盒(GMS10391.2)购自上海杰美生物技术有限公司，兔抗大鼠Caspase-3(NO.ab13847)一抗及羊抗兔HRP(NO.ab6721)二抗购自美国Abcam公司。

用Feeney法^[4]按自由落体致伤原理，重40 g击锤从30 cm高处自由落下冲击撞杆，造成右侧大脑皮质运动区中度挫裂伤。术后连续肌肉注射青霉素10万U持续1周。假手术组大鼠仅切开颅部皮肤，缝合。

常压高氧治疗于脑外伤后2 h，将大鼠置于动物氧舱内，用纯氧洗舱10 min后，维持在常压水平4 h，间断性舱内给氧以维持纯氧状态(氧浓度仪监测氧浓度)。此为1次治疗，治疗2次/d；高压氧治疗同上，匀速加压10 min至0.2 MPa稳压1 h，后再行3 h常压氧治疗，此为1次治疗，治疗2次/d。

神经功能缺损评分于术后根据Bederson五级评分标准评分^[5]。

参照Morris方法检测空间记忆能力^[6]，包括在定位航行试验以及空间搜索试验。

将外科缝线标记后的大鼠固定于脑立体定位仪，颅顶皮肤正中切口，暴露顶骨，将针式激光探针固定在大鼠前囟后1.5 mm中线右侧旁开5 mm 处，该点为大脑中动脉缺血中心区。利用激光多普勒血流仪进行缺血区脑血流量(CBF)监测，术前固定在颅骨稳定15 min 后记录血流读数。

将固定后的1 mm³脑组织块取出,常规电镜样品制备程序漂洗、脱水、浸透及环氧树脂包埋,样品切片机中切片，获得80 nm的切片，将切片捞至载网上,干燥后行醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，即可在透射电镜中观察网孔中细胞线粒体形态结构并拍照。

各组冰盘上迅速断头取脑，于30 s内迅速取出损伤半暗带脑组织，去软脑膜，根据GENMED活体组织线粒体膜电位荧光测定试剂盒，最后荧光分光光度计测定。

取脑如上述，用冰冷的生理盐水冲洗后，取预冷的生理盐水按质量体积比1∶ 9，制备成10%脑组织匀浆，4 ℃ 5 000g离心15 min，取上清液，-80 ℃ 冰箱保存待测。SOD的测定用黄嘌呤氧化酶法按试剂盒说明书中操作步骤进行，于450 nm 处用酶标仪吸光度。MDA 的测定采用硫代巴比妥酸法，于532 nm 处用酶标仪测吸光度。脑组织匀浆中蛋白质含量的测定采用BCA法。

将动物深度麻醉后，经左心室行主动脉插管，肝素生理盐水冲洗，快速灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液( pH 7.4,4 ℃ ) 500 mL，断头取脑，浸入上述固定液中24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋,冠状连续切片，片厚4 μm；参照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明操作，沿伤区与正常脑组织交界处的皮层各随机选取5~7个40×10不重叠视野，计数每个视野内TUNEL阳性细胞数，计算其平均数；并进而计算各组动物的TUNEL阳性细胞数(胞核呈棕黄色颗粒)。

将动物深度麻醉后经左心室行主动脉插管，快速灌注冰盐水200 mL，断头取脑，用预冷过的刀片取损伤周边1 mm脑组织即缺血半影区，经匀浆、蛋白裂解、定量后，再通过转膜、封闭、灌胶、上样、转膜、抗体结合、显影、拍照。利用图像成像分析软件Image Pro Plus 6.0 计算条带的 IOD 值，结果以样本的抗体和相应GAPDH的两个IOD值的相对比来表示。实验重复3次。

用SPSS 17.0统计分析软件处理数据，计量资料用均数±标准差( x±s )表示。根据数据资料特征，采用单因素方差分析(ANOVA)LSD-t检验进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

通过Bederson评分系统，评估常压高氧治疗3 d～3周后神经功评分情况。结果显示，常压高氧治疗3 d～3周后，各组神经功能缺失随时间逐渐减小；在治疗3 d后，与Vehicle组比较，常压高氧治疗及高压氧治疗组神经功能缺损差异无统计学意义(P> 0.05)；而在治疗1、2、3周后常压高氧治疗及高压氧治疗组神经功能缺失明显减小，差异具有统计学意义(P<0.01及P<0.05)(图 1)。研究结果表明，常压高氧治疗能够明显改善脑外伤大鼠神经功能缺损，与高压氧治疗组疗效一致。

与Vehicle组同一时间点比较，bP<0.05，aP<0.01 图 1 各组大鼠脑外伤后神经功能缺失严重程度评分比较( x±s ,n=10)

图选项

为评估常压高氧治疗对大鼠空间学习记忆功能的影响，我们选择常压高氧治疗后2周行水迷宫实验。结果显示，所有各组大鼠在空间记忆实验训练中逐渐缩短了寻找平台的时间；在训练第1至5天，与Vehicle组比较，Sham组寻找平台的时间均减小，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，在训练第1至2天，与Vehicle比较，无论常压高氧治疗还是高压氧治疗组寻找平台的时间下降不明显，差异均无统计学意义(P>0.05)；但在训练3~4 d，两治疗组寻找平台的时间减小，差异具有统计学意义(P<0.05)；在训练第5天，无论常压高氧治疗还是高压氧治疗组寻找平台的时间均显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)(图 2A)。研究结果表明，高压常压治疗能够明显改善大鼠脑梗死后的空间学习记忆功能，并且呈时间依赖性。在空间探索实验中，与Vehicle比较，高压常压及高压氧治疗组在目标象限寻找平台的时间显著增加，两组差异均具有统计学意义(P<0.01)(图 2B、C)。

A：各组大鼠寻找平台时间比较；B：各组大鼠寻找目标象限轨迹图；C：各组大鼠寻找目标象限时间比较；与Sham组同一时间点比较，aP<0.05；与Vehicle组同一时间点比较，bP<0.05，cP<0.01 图 2 各组脑外伤大鼠Morris水迷宫空间记忆和空间探索能力比较( x±s ,n=10)

图选项

为了观察常压高氧治疗对脑外伤大鼠缺血区CBF的影响，选择监测大鼠MCAO前，3 d、1、2和3周缺血区CBF变化，结果显示，在治疗3 d后，常压高氧治疗组以及高压氧治疗组局部CBF增加不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，在1～3周后，常压高氧治疗组以及高压氧治疗组CBF均明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)(图 3)。研究结果表明，常压高氧治疗能够明显改善脑外伤大鼠缺血区的CBF，并且呈时间依赖性。

与Vehicle组同一时间点比较，aP< 0.01 图 3 各组脑外伤大鼠缺血区脑血流量比较( x±s ,n=10)

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为了观察常压高氧治疗对脑外伤大鼠线粒体形态的影响，本研究通过电镜检测治疗后1周线粒体形态的变化。结果显示，与Sham组比较，各组线粒体形态均有明显改变，出现线粒体膜破裂、线粒体嵴消失、线粒体内出现空泡化；Vehicle组线粒体膜出现断裂、形态较大、肿胀明显，线粒体内出现空泡化，线粒体嵴消失；与Vehicle组比较，常压高氧及高压氧组线粒体膜基本完整，肿胀程度较模型组减轻，线粒体嵴尚存在，未见明显空泡化现象；常压高氧和高压氧组比较，线粒体形态差异不显著(图 4)。

Sham组细胞线粒体形态基本正常，线粒体膜完整及线粒体嵴存在；Vehicle组细胞线粒体膜出现断裂、形态较大、肿胀明显，线粒体内出现空泡化，线粒体嵴消失；HN及HBO组线粒体膜基本完整，肿胀程度较Vehicle组减轻，线粒体嵴尚存在，未见明显空泡化现象 图 4 各组大鼠脑外伤后缺血半影区透射电镜下组织线粒体形态变化(×30 000)

图选项

与假手术组MMP比较，各组MMP均有明显下降，与模型组比较，常压高氧组MMP有明显升高(P<0.05)，高压氧组MMP也有明显升高(P<0.01)，差异具有统计学意义；与常压高氧组比较，高压氧组MMP有升高趋势，但是差异无统计学意义 (P>0.05)(表 1)。

与假手术组比较，各组线粒体MDA均有明显升高；与模型组比较，常压高氧及高压氧组线粒体MDA有明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与常压高氧组比较，虽高压氧组线粒体MDA增高，但差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。与假手术组比较，各组线粒体SOD均有明显升高；与模型组比较，常压高氧及高压氧组线粒体SOD有明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；常压高氧与高压氧组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。

TUNEL染色阳性细胞核呈棕黄色，阴性细胞核为蓝色，假手术组可见大量蓝色的阴性细胞，偶可以阳性凋亡细胞，外伤模型组挫伤半影区可见阳性细胞核染色深，而常压高氧及高压氧组可见部分阳性细胞，核染色较模型组稍浅(图 5A)；与模型组比较，常压高氧(P<0.05)及高压氧组(P<0.01)阳性细胞计数明显下降，差异均有统计学意义，高压氧组与常压高氧组比较，阳性细胞数目减少趋势，但差异无统计学意义(图 5B)。

与Vehicle组比较，aP< 0.01 图 5 各组大鼠脑外伤后缺血半影区TUNEL阳性细胞表达情况比较( x±s ,n=6)

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为了进一步探讨常压高氧治疗对细胞凋亡相关蛋白的影响，本研究检测常压高氧治疗1周后caspase-3的变化。结果显示，sham组表达量较低，vehicle组caspase-3蛋白表达较强，与vehicle组比较，常压高氧组及高压氧组caspase-3蛋白表达明显下降(P<0.01)，常压高氧组与高压氧组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图 6)。

与Vehicle组比较，aP< 0.01 图 6 各组脑外伤大鼠缺血半影区Caspase-3 蛋白表达的变化( x±s ,n=4)

图选项

在颅脑损伤患者中，脑缺血缺氧是继发性损伤中最常见的病理改变，并且是脑外伤后重要的预后影响因素，脑损伤后由于暴力的作用减弱，造成一个介于正常与损伤区之间的区域称为半影区。半影区虽不属于直接损伤，但是由于血肿形成、继发的血管收缩、静脉回流障碍等原因造成局部神经元处在低灌注的环境影响细胞而造成线粒体功能的受损，神经细胞的有氧呼吸和代谢功能受到明显影响，在数分钟后，就会出现继发性的级联式扩大的脑损害，并持续数小时到数天，这种继发性病理生理的改变，不仅会加重核心区细胞的损伤，使细胞坏死的面积增大，还会导致半影区的神经细胞逐渐趋向死亡^[1]。因此，如何改善缺血半影区细胞能量代谢，阻断脑外伤后的继发性病理生理改变，保护半影区神经细胞的功能，是目前脑外伤研究的重点之一。

细胞凋亡是脑外伤后继发性神经损伤的重要机制，细胞凋亡的调控，主要有三条诱导途径：外源性途径(即死亡受体途径),内源性途径(即线粒体途径)，以及内质网途径^{[7, 8]}。不同的死亡信号通过不同的途径诱导细胞凋亡，研究表明线粒体在细胞凋亡调控过程中起重要作用，它不仅是内源凋亡通路的感应器，还是凋亡信号的放大器，可使细胞凋亡快速高效地进行。大量的动物实验及临床研究证实线粒体功能障碍，导致细胞内信号级联反应，引起细胞凋亡^{[1, 9]}。本研究通过电镜检测细胞线粒体形态，结果表明，脑外伤大鼠缺血半影区细胞线粒体膜出现断裂、形态较大、肿胀明显，线粒体内出现空泡化，线粒体嵴消失，充分表明线粒体功能障碍参与脑外伤后神经功能损伤。

线粒体是体内氧自由基(ROS)产生的主要来源^[10]，生理条件下线粒体内存在着有效的抗氧化机制，可将代谢中产生的ROS及时清除，使脂质过氧化产物MDA生成减少，线粒体和神经元不致遭受过氧化损害。当脑外伤引起缺血缺氧后线粒体在呼吸链电子传递障碍，ROS大量产生，攻击线粒体内膜，从而导致线粒体结构和功能异常。本研究也显示大鼠脑损伤后细胞线粒体MDA明显升高，而抗氧化产物SOD显著减少，表明ROS与线粒体功能代谢有直接相关。MMP破坏被认为是线粒体凋亡途径级联反应过程中最早发生的事件之一，是细胞凋亡的早期标志^[11]。在损伤早期，线粒体膜电位下降，即可引起线粒体膜间隙的CytC释放至胞质，释放入胞质的CytC特异地与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合成复合体，启动Caspase家族蛋白酶，导致细胞凋亡^{[12, 13, 14]}。Caspase-3被认为是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase-3活化导致不可逆的细胞凋亡。本研究证实脑外伤大鼠缺血半影区线粒体MMP明显下降，Caspase-3蛋白表达显著增加，细胞凋亡比例明显增加。因此，本研究表明线粒体途径细胞凋亡在大鼠脑外伤后继发损伤过程中具有重要作用。

常压高氧是指氧浓度在一个大气压下吸入100%纯氧，与高压氧比较，在临床应用上，有其独特的优势，其应用简单、便宜、非侵袭能够，能够在第一时间早期迅速运用，尤其在重型颅脑外伤患者中，可以早期应用呼吸机给予高浓度氧治疗，弥补高压氧的局限性^[3]；但是高氧治疗具有氧毒性不良反应，然而近期临床实验研究表明常压高氧治疗患者脑脊液中氧化应激生化指标F2-异前列腺素及蛋白质巯基并没有明显增加^{[1, 3, 14]}，而且Rockswold等^[2]通过前瞻性随机对照研究，发现常压高氧治疗患者支气管肺泡内的炎症因子IL-6及IL-8等也没有增加，进一步表明常压高氧治疗并没有增加肺部细胞氧毒性。因此早期常压高氧是一种较为安全可靠有效的方法，为重型脑外伤患者神经功能恢复提供新的治疗措施。而且，本研究还表明，常压高氧能够明显降低脑外伤大鼠神经功能缺损，改善大鼠空间学习记忆能力，并且通过与高压氧治疗比较，其疗效基本一致，表明常压高氧治疗在临床应用的潜在价值。

常压高氧如何减少脑外伤的机制目前尚不清楚，最近的研究表明，常压高氧治疗能够增加患者动脉氧浓度和氧分压，同样能提高弥散到脑组织中的氧分压(PbtO₂)，增加ATP合成，提高线粒体的功能^{[3, 16]}；许多学者通过微透析技术检测早期常压高氧治疗脑外伤患者，发现患者脑脊液中葡萄糖的水平升高，而乳酸的含量明显下降，并且减少乳酸/葡萄糖和乳酸/丙酮酸比率^{[3, 15, 16]}，表明常压高氧能够提高大脑的氧化还原状态；而且研究表明常压高氧能够降低患者颅内压，从而促进神经功能恢复^{[1, 3, 16]}。而且，本研究表明，常压高氧能够明显时间依赖改善脑外伤大鼠缺血区的脑血流量，从而增加脑组织血流灌注，有助于减轻缺血半影区脑组织的缺血缺氧损伤。

本研究进一步探讨常压高氧对线粒体通路细胞凋亡的影响，研究表明常压高氧能够明显增加线粒体SOD、减少线粒体MDA的产生，逆转线粒体MMP，改善线粒体功能及结构，减少细胞凋亡和凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白表达。因此，笔者推测其机制可能通过增加局部的脑血流量，改善缺血半影区脑组织的能量代谢，从而减少线粒体氧自由基物质对线粒体的损伤和降低凋亡相关蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡。

综上所述，常压高氧治疗能够促进脑外伤后神经功能恢复，有望为患者尤其是重型脑外伤患者的早期治疗提供一种新的治疗途径，其在脑外伤中起保护作用的机制可能是通过抑制线粒体途径细胞凋亡。