温州医科大学附属第一医院急诊科(卢中秋、李冬)
脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征,发病急,病情进展迅速,而且其发病率和病死率近几十年来有逐年增加的趋势,是危重病患者最常见的死亡原因之一[1, 2]。脓毒症时细菌及其毒素可作用于吞噬细胞,生成大量代谢产物,如丙二醛(MDA)等,引起细胞水肿、溶酶体破裂等效应而导致肝脏损伤[3, 4]。如何防止细胞损伤尤其重要,其中转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)级Nrf2信号路径调节[5]在防御机制中起着非常重要的作用。这些物质对机体抗炎,抗氧化应激能力的提高有着重要的作用[6]。Clark等[7]研究证实小剂量辣椒素(CAP)能与辣椒素受体(VR)结合,降低脂质过氧化物MDA,保护肝脏。国内外鲜有相关研究报道辣椒素是否通过调节Nrf2氧化应激通路指标,抑制氧化应激反应,进而保护肝脏。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级雄性ICR小鼠108只,体质量(20.5±2.8)g,由温州医科大学动物实验中心提供。
1.2 实验试剂与仪器DNA ladder(美国Thermo公司),彩色预染蛋白分子量标准(上海碧云天生物技术研究所),PCR引物(上海基康生物工程公司),逆转录-PCR试剂盒(美国Thermo scientific公司),核蛋白抽提试剂盒(上海碧云天生物技术研究所),Tap PCR master mix试剂盒(北京天根生化科技公司),内毒素(又称脂多糖,LPS)(美国sigma公司),CAP(美国sigma公司),CAPZ(美国sigma公司),Bio-rad mini-proteinⅢ电泳仪及电转移系统(美国BioRAD公司)。
1.3 实验动物分组及处理雄性ICR小鼠108只,体质量(20.5±2.80)g,实验前禁食8 h,禁水4 h。将该小鼠随机(随机数字法)分为6组(正常对照组;CAP对照组;CAPZ对照组;内毒素血症模型组;CAP干预组;CAPZ干预组),每组18只。正常对照组:小鼠腹腔中注射生理盐水;CAP对照组、CAPZ 对照组:先分别给两组小鼠皮下注射CAP(1 mg/kg)、CAPZ(15 mg/kg),30 min后小鼠腹腔内注射生理盐水;内毒素血症模型组:先给小鼠腹腔注射内毒素10 mg/mL,构建成内毒素血症模型;CAP干预组、CAPZ干预组:先分别给两组小鼠皮下注射CAP(1 mg/kg)、CAPZ(15 mg/kg),30 min腹腔中注射内毒素 10 mg/kg。
1.4 实验方法将实验组小鼠分别于3、8、16 h麻醉后活杀并取出肝组织,置于-70 ℃冰箱保存。然后通过化学比色法检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)变化,肝组织MDA、SOD变化; ELISA法测定各组小鼠肝组织细胞核内Nrf2的水平;RT-PCR法测定各组小鼠肝组织内Nrf2表达量。蛋白免疫印迹法(western blotting)检测小鼠肝组织细胞核内Nrf2的蛋白量。
1.5 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计分析,计量资料均以均数±标准差( x±s )表示,对各组数据先进行正态检验和方差齐性检验,组间比较采用LSD-t检查。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 内毒素血症小鼠的一般情况、行为学变化及辣椒素干预常规组(正常对照组、CAP 对照组、CAPZ 对照组)小鼠反应灵敏,呼吸平稳,皮毛光滑,行动自如。内毒素血症模型组小鼠在2 h左右出现精神萎靡,倦怠懒动,反应变慢,进食减少;8 h上述症状加重,反应迟钝,眼部可见较多分泌物,四肢发抖;16 h精神进一步萎靡,刺激后无反应,口唇发绀,未见黄疸。干预组CAP干预组小鼠症状较内毒素血症模型组减轻,而CAPZ干预组小鼠上述症状加重。
2.2 内毒素血症小鼠ALT、AST血清中的变化及辣椒素干预与正常对照组比较,内毒素血症模型组ALT 3 h(55.3±4.5)U,8 h(63.2±5.0)U,16 h(71.6±3.7)U 明显增高(P<0.05);与内毒素血症模型组比较,CAP干预组ALT 3 h(49.8±4.4)U,8 h(56.1±3.1)U,16 h(62.7±2.8)U 明显减少(P<0.05);CAPZ干预组血清ALT明显增高(P<0.05),见表 1。
组别 | 3 h | 8 h | 16 h |
正常对照组 | 50.0±4.1 | 43.1±4.9 | 37.9±3.8 |
CAP 对照组 | 43.9±1.5 | 42.7±4.5 | 43.1±4.5 |
CAPZ 对照组 | 45.5±3.9 | 42.3±4.3 | 41.6±3.7 |
内毒素血症模型组 | 55.3±4.5a | 63.2±5.0a | 71.6±3.7a |
CAP干预组 | 49.8±4.4 | 56.1±3.1b | 62.7±2.8b |
CAPZ干预组 | 66.5±4.5c | 72.1±3.1c | 84.6±3.9c |
注:内毒素血症模型组与正常对照组比较,aP<0.05;CAP干预组与内毒素血症模型组比较,bP<0.05;CAPZ干预组与内毒素血症模型组比较,cP<0.05 |
AST:与正常对照组比较,内毒素血症模型组AST 3 h(76.3±11.5)U,8 h(63.2±5.0)U,16 h(148.2±21.9)U 明显增高(P<0.05);与内毒素血症模型组比较,CAP干预组AST 3 h(49.8±4.4)U,8 h(56.1±3.1)U,16 h(62.7±2.8)U 明显减少(P<0.05);CAPZ干预组血清AST明显增高(P<0.05),见表 2。
组别 | 3 h | 8 h | 16 h |
正常对照组 | 48.4±6.7 | 50.1±4.8 | 50.9±3.5 |
CAP 对照组 | 52.5±4.7 | 46.5±4.2 | 48.9±3.2 |
CAPZ 对照组 | 50.7±3.4 | 50.2±2.6 | 48.1±4.8 |
内毒素血症模型组 | 76.3±11.5a | 141.5±27.9a | 200.5±20.2a |
CAP干预组 | 60.3±8.1b | 97.2±6.6b | 148.2±21.9b |
CAPZ干预组 | 83.5±11.7c | 151.8±27.5c | 227.3±25.3c |
注:内毒素血症模型组与正常对照组比较,aP<00.05;CAP干预组与内毒素血症模型组比较,bP<00.05;CAPZ干预组与内毒素血症模型组比较,cP<00.05 |
与正常对照组比较,内毒素血症模型组脂质过氧化损伤标志物MDA(nmol/mg prot) 3 h(49.9±2.6),8 h(44.4±1.3),16 h(29.1±21.3)明显增高(P<0.05);与内毒素血症模型组比较:CAP干预组MDA 3 h(41.4±6.5),8 h(44.8±0.8),16 h(27.0±20.7)明显减少(P<0.05);CAPZ干预组MDA明显增高(P<0.05),见表 3。
组别 | 3 h | 8 h | 16 h |
正常对照组 | 29.9±9.5 | 26.0±3.9 | 13.2±10.1 |
CAP 对照组 | 32.3±8.1 | 29.9±0.5 | 21.6±19.4 |
CAPZ 对照组 | 38.3±4.1 | 26.2±0.5 | 17.3±14.8 |
内毒素血症模型组 | 49.9±2.6a | 44.4±1.3a | 29.1±21.3a |
CAP干预组 | 41.4±6.5b | 44.8±0.8b | 27.0±20.7b |
CAPZ干预组 | 57.6±1.4c | 80.2±14.4c | 40.7±25.3c |
注:内毒素血症模型组与正常对照组比较,aP<0.05;CAP干预组与内毒素血症模型组比较,bP<0.05;CAPZ干预组与内毒素血症模型组比较,cP<0.05 |
与正常对照组比较,内毒素血症模型组抗氧化酶SOD(U/mg prot) 3 h(217.5±67.4),8 h(244.3±26.0),16 h(238.9±20.3)明显增高(P<0.05);与内毒素血症模型组(D组)比较,CAP干预组MDA 3 h(351.6±138.0),8 h(359.9±166.6),16 h(280.5±43.2)明显增高(P<0.05);CAPZ干预组MDA无明显变化(P>0.05),见表 4。
组别 | 3 h | 8 h | 16 h |
正常对照组 | 150.6±61.4 | 199.1±2.4 | 171.6±18.1 |
CAP 对照组 | 150.0±58.5 | 147.2±32.0 | 153.4±38.6 |
CAPZ 对照组 | 185.1±70.2 | 162.1±52.1 | 152.1±44.4 |
脓毒症模型组 | 217.5±67.4 | 244.3±26.0 | 238.9±20.3a |
CAP干预组 | 351.6±138.0b | 359.9±166.6b | 280.5±43.2b |
CAPZ干预组 | 208.3±72.8 | 182.9±67.3 | 220.5±22.0c |
注:内毒素血症模型组与正常对照组比较,aP<0.05;CAP干预组与内毒素血症模型组比较,bP<0.05;CAPZ干预组与内毒素血症模型组比较,cP<0.05 |
与正常对照组比较,内毒素血症模型组Nrf2蛋白表达量3 h(0.64±0.13),8 h(0.78±0.09),16 h(0.58±0.13)明显增高(P<0.05);与内毒素血症模型组比较:CAP干预组Nrf2蛋白表达量3 h(0.81±0.14),8 h(0.92±0.13),16 h(0.61±0.08)明显增高(P<0.05);CAPZ干预组Nrf2蛋白表达量下降(P<0.05)。见表 5、图 1。
组别 | 3 h | 8 h | 16 h |
正常对照组 | 0.33±0.08 | 0.45±0.02 | 0.35±0.08 |
CAP 对照组 | 0.39±0.14 | 0.44±0.08 | 0.43±0.08 |
CAPZ 对照组 | 0.47±0.13 | 0.51±0.04 | 0.45±0.17 |
脓毒症模型组 | 0.64±0.13a | 0.78±0.09a | 0.58±0.13a |
CAP干预组 | 0.81±0.14b | 0.92±0.13b | 0.61±0.08b |
CAPZ干预组 | 0.56±0.19c | 0.68±0.04c | 0.42±0.07 |
注:内毒素血症模型组与正常对照组比较,aP<0.05;CAP干预组与内毒素血症模型组比较,bP<0.05;CAPZ干预组与内毒素血症模型组比较,cP<0.05 |
与正常对照组比较,内毒素血症模型组Nrf2 mRNA 3 h(2.16±0.53),8 h(2.35±0.29),16 h(2.17±0.35)明显增高(P<0.05);与内毒素血症模型组比较:CAP干预组Nrf2 mRNA 3 h(3.27±0.45),8 h(3.27±0.45)增高,16 h(3.12±0.56)增高明显(P<0.05);CAPZ干预组Nrf2 mRNA变化不大(P>0.05),见表 6。
组别 | 3 h | 8 h | 16 h |
正常对照组 | 1.81±0.26 | 0.57±0.17 | 1.78±0.25 |
CAP 对照组 | 0.50±0.07 | 0.96±0.22 | 0.45±0.08 |
CAPZ 对照组 | 1.46±0.32 | 1.74±0.32 | 2.04±0.29 |
脓毒症模型组 | 2.16±0.53a | 2.35±0.29a | 2.17±0.35a |
CAP干预组 | 3.27±0.45 | 3.27±0.45 | 3.12±0.56b |
CAPZ干预组 | 2.25±0.43c | 2.57±0.36c | 2.44±0.13c |
注:与正常对照组比较,aP<0.05;与内毒素血症模型组比较,bP<0.05,cP>0.05 |
光镜下(HE×400)观察:正常对照组(3 h)肝细胞未见明显水肿;辣椒素对照组 (3 h)肝小叶结构正常,未见肝细胞水肿变性及脂肪变性,门管区内未见炎细胞浸润;内毒素组(3 h)肝细胞水肿明显;辣椒素干预组(3 h)肝细胞水肿减轻,变性不明显,未见点状坏死;辣椒素碱干预组(16 h)肝脏细胞水肿明显;辣椒素干预组(16 h)肝细胞水肿较辣椒素碱干预组、内毒素组减轻,见图 2。
3 讨论细菌内毒素存在于革兰阴性菌胞壁上,它主要由核心多糖、O-特异性链和类脂A三部分组成,是内毒素致病效应的关键,因此内毒素在炎症和细菌感染动物模型的构建中应用较为广泛。肝脏是内毒素代谢的重要器官,肝脏存在多种内毒素相关受体,能识别内毒素同时也启动内毒素激活细胞释放炎症因子等产物。内毒素在小鼠体内的代谢已被证明高动力性状态持续从2~10 h,衰减的状态发生在内毒素后16~20 h[8]。因此,本实验选择3 h、8 h、16 h三个时间点,向小鼠腹腔内注射内毒素来建立脓毒症模型,通过病理切片观察发现内毒素血症小鼠在造模后随着时间的延长,肝细胞损伤程度进一步加深,肝细胞出现水肿、变性,部分见小灶性点状坏死,同时肝脏转氨酶ALT、AST逐渐升高。因此该模型是构建成功的。
研究发现,ICU病房中近40%的患者存在脓毒症,病死率甚至可高达36%[9],脓毒症相关的多脏器功能不全综合征仍然是危重病医学当前面临的棘手问题。肝脏是炎症反应最常涉及的靶器官之一,在脓毒症的疾病进展各期都可发生急性肝损伤,肝功能不全是脓毒症发展为MODS的标志之一[9]。肝脏内80%的巨噬细胞是人体的固有枯否细胞(KCs)[10],肝内的Kupffer细胞具有强大的吞噬能力,且产生的超氧阴离子可杀灭细菌,在局部的炎症反应情况下,对细菌清除和损伤组织修复具有促进作用。但当炎症反应异常放大,打破平衡时,炎症反应对机体就会造成损害,Kupffer细胞被过度激活后释放氧自由基[11],机体的氧化/还原平衡的失衡,造成肝细胞的损害。
目前认为细菌毒素的直接损害,系统性炎性反应的肝脏损害,氧化应激损伤等是脓毒症肝脏损伤机制[12]。氧化应激通过与生物大分子共价结合以及破坏酶的活性,启动膜脂质过氧化机制,从而改变生物膜功能等,引起不同程度的肝损伤,故这一机制成为抗氧化治疗防治肝脏疾病的基础[13, 14]。在氧化应激过程中机体产生过多的活性氧自由基(ROS)能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,形成脂质过氧化物MDA,通过测定其含量可间接反映出细胞氧化损伤程度[15]。脓毒症时该指标升高,血浆抗氧化水平明显低于炎症控制者[16]。调节体内的氧化和抗氧化平衡的是SOD,它可以降低脂质过氧化物的合成,维护细胞膜结构和功能的完整[17]。在调控抗氧化应激反应中,Nrf2(NF-E2-related factor2)起着重要作用,它具有维护细胞氧化/抗氧化平衡,抗炎、抑制凋亡的活性[18, 19]。本实验内毒素处理的内毒素血症组Nrf2蛋白含量、Nrf2mRNA,SOD,MDA均高于正常对照组,晚期(16 h)各项指标含量下降,说明内毒素血症小鼠存在氧化应激反应上调Nrf2,启动调控下游的抗氧化酶SOD的表达增加细胞抗氧化应激。MDA升高提示肝细胞氧化损伤,脓毒症晚期(16 h)随着内毒素的衰减,氧化应激反应减弱。
辣椒素具有非常显著的细胞特异性,可激活无髓鞘C纤维上的非特异性离子通道-辣椒素受体,产生广泛的生物学活性[20]。体外研究显示,辣椒素能有效地抗氧化,能阻止活性氧自由基ROS产生[21]。研究证实全身用药辣椒素1 mg/kg能减少各种组织中的脂质过氧化物,包括肺和肝脏,小剂量辣椒素预处理内毒素血症组可减少的氧化应激损伤[7]。辣椒素碱(CAPZ)是辣椒素的竞争性拮抗剂,可以阻断辣椒素与辣椒素受体结合,作用相反。实验辣椒素干预的CAP干预组早期、晚期Nrf2蛋白含量,Nrf2mRNA,SOD均高于内毒素血症模型组,说明CAP干预组1 mg/kg辣椒素能有效地提高Nrf2启动调控下游的抗氧化酶SOD的表达增加细胞抗氧化应激。同时MDA,ALT、AST均低于内毒素血症模型组,说明辣椒素能减少脂质过氧化物合成,维护氧化和抗氧化平衡,减轻肝脏损伤。实验中辣椒素拮抗剂辣椒素碱干预的CAPZ干预组Nrf2蛋白含量,Nrf2mRNA,SOD均低于内毒素血症模型组,说明CAPZ干预组辣椒素碱不能提高Nrf2启动调控下游的抗氧化酶SOD的表达,不能增加细胞抗氧化应激。MDA,ALT、AST均高于内毒素血症模型组说明辣椒素碱增加脂质过氧化物合成,氧化和抗氧化失衡,进一步加重肝脏损伤。
综上所述,辣椒素可能通过抑制Nrf2氧化应激通路,减轻氧自由基对肝脏的损伤,这可能是辣椒素减轻肝脏损伤的机制之一。
[1] | Blanco J, Muriel-Bombín A, Sagredo V, et al. Incidence, organ dysfunction and mortality in severe sepsis:aSpanish multicentre study[J]. Crit Care,2008, 12(6):R158-161. |
[2] | Martin GS, Mannino DM, Eaton S, et al. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000[J].N EnglJMed, 2003, 348(15):1546-1554. |
[3] | Dhainaut JF, Marin N, Mignon A, et al. Hepatic response to sepsis: interaction between coagulation and inflammatory processes[J].Crit Care Med, 2001, 29(16):S42-47. |
[4] | Kaplowitz N. Mechanisms of liver cell injury[J]. Hepatol, 2000, 32(1 suppll):39-47. |
[5] | 蔡维霞,张军,胡大海. 氧化和化学应激的防御性转导通路[J].中国生物化学与分子生物学报, 2009, 25(4):297-303. |
[6] | Lee JM, Johnson JA. An important role of Nrf2-ARE pathway in the cellular defense mechanism[J].JBiochem Mol Biol, 2004,37 (2) : 139-143. |
[7] | Clark N, Keeble J, Fernandes ES,et al. The transient receptor potential vanilloid 1(TRPV1) receptor protects against the onset of sepsis after endotoxin[J].FASEB J,2007,21(11):3747-3755. |
[8] | Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome and associated costs of care[J].Crit Care Med,2001, 29(12):1303-1310. |
[9] | Gordon Ac,Lagan Al,Aganna E,et al. TNF and TNFR polymorphisms in severe sepsis and septic shock:a prospective multicentre study[J].Genes Immun, 2004, 5(8):631-640. |
[10] | Katz S, Jimenez MA, Lehmkuhler WE, et al. Liver bacterial clearance following hepatic artery ligation and portacaval shunt[J].JSurg Res, 1991, 51(7):267-270. |
[11] | Koo DJ, Chaudry IH, Wang P. Kupffer cells are responsible for producing inflamatory cytokines and hepatocellular dysfunction during early sepsis[J].JSurg Res, 1999, 83(6):151-157. |
[12] | 祝益民,罗海燕. 脓毒症儿童肝脏损伤[J].实用儿科临床杂志, 2008,18(23):1400-1402. |
[13] | Poli G. Pathogenesis of liver fibrosis: role of oxidative stress[J]. Mol Aspects Med, 2000, 21(5): 49-98. |
[14] | Gebhardt R. Oxidative stress, plant-derived antioxidants and liver fibrosis[J].Planta Med, 2002, 68(4): 289-296. |
[15] | Fattman CL, Schaefer LM, Oury TD. Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine [J]. Free Radic Biol Med, 2003,35(3):236-256. |
[16] | Goode HF, Cowley HC, Walker BE, et al. Decreased antioxidant status and increased lipid peoxidation in patients with septic shock and secondary organ dysfunction[J]. Crit Care Med, 1995, 23(4):646-651. |
[17] | Iamai INA, Okasha SH, Dhawan A, et al. Antioxidant enzyme activities in hepatic tissue from children with chronic liver disease [J].SaudiJGastroenterol, 2010, 16(2):90-94. |
[18] | 钟敏.Nrf2-Keapl抗氧化系统研究进展[J].中国公共卫生, 2006,22(3):360-362. |
[19] | Ohta T, Iijima K, Miyamoto M. Loss of keapl function activates Nrf2 and provides advantages for lung cancer cell growth [J].Cancer Res, 2008, 68(3):1303-1309. |
[20] | 骆昊, 万有, 韩济生. 辣椒素及其受体[J]. 生理科学进展, 2003, 34(1):11-15. |
[21] | Joe B, Lokesh BR. Role of capsaicin, curcumin and dietary n-3fatty acids in lowering the generation of reactive oxygen speciesin rat peritoneal macrophages[J]. Biochim Biophys Acta, 1994, 1224(2):255-263. |