2015, Vol. 24
内毒素休克可致急性肺损伤，严重者可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)甚至多器官功能衰竭，病死率较高[1]。因此，探索其具体的发病机制有利于启发新的临床治疗思路。研究证实，电针刺激足三里和肺俞穴，能够起到对内毒素休克致急性肺损伤的保护作用[2]。笔者前期研究也发现，Nrf2-ARE通路激活对内毒素休克急性肺损伤起适应性调节[3]。蛋白激酶C(PKC)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛存在于机体的组织细胞内，包括12种同工酶，PKC-α是其中之一[4]。在某些条件下激活后，PKC可通过磷酸化下游蛋白，激活蛋白激酶并诱导几种核转录因子的表达，从而对细胞的氧化应激反应、炎症反应等起重要作用[5]。Numazawa等[6]研究发现PKC可直接磷酸化核因子E2p45相关因子2(Nrf2)使其与Keapl分离，并诱导其转入胞核，识别并结合ARE，调控其靶基因，进而发挥其抗氧化作用，而PKC是否参与电针刺减轻兔内毒素休克致急性肺损伤中Nrf2的表达尚未见相关报道。本研究拟讨论PKC在电针刺干预兔内毒素休克致急性肺损伤中Nrf2表达的作用。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器脂多糖(批号：L2630，Sigma公司，美国)；PKC抑制剂(白屈菜红碱,Enzo公司，美国)；兔Nrf2多克隆抗体(批号：Orb1116，稀释度1∶ 1 000，Biorbyt公司，英国)；总RNA 提取试剂盒与RT-PCR 试剂盒 (均购自Tiangen公司)；核蛋白及总蛋白提取试剂盒 (均购自Thermo公司)；山羊抗兔lgG抗体 (稀释度1∶ 3 000，北京康为世纪生物科技有限公司)； Hellige 监护仪( 德国)；G6805-1A低频电子脉冲治疗仪(上海华谊医用仪器有限公司)； SOD活性测定试剂盒及MDA含量测定试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)； 多功能酶标仪(BioTek Synergy，美国)；Gem premier 3000血气分析仪(GE公司，美国)；实时定量PCR仪(LineGene9620，BIOER，中国)；荧光显微镜(Olympus，日本) ；Quantity One凝胶成像分析系统 (BIO-Rad公司，美国)。
1.2 动物选择与分组健康清洁级雄性新西兰大白兔80只，2个月龄，体质量1.5~2.0 kg，由天津市中国医学科学院生物工程研究所(许可证号: SCXK(京)2011-0008) 提供，在室温18~22 ℃安静环境中饲养，昼夜交替，常规饮食1周后进行实验。采取随机数字表法，将其随机(随机数字法)分为8组(n=10)：对照组(C组)、内毒素休克诱发急性肺损伤组(ALI组)、电针刺激穴位+ALI组(EL组)、电针刺激非穴位+ALI组(NA-EL组)、PKC阻断剂组(G组)、二甲基亚砜组(D组)、PKC阻断剂+ALI组(GL组)、电针刺组+PKC阻断剂+ ALI组(EGL组)。
1.3 电针刺处理依据中国针灸学会实验针灸研究会制定的《动物针灸穴位图谱》，EL组、EGL组选取兔双侧内关穴 (腕关节根部至肘关节正中连线前1/6处)、足三里穴 (膝关节外下方腓骨小头下约5 mm处)和肺俞穴 (第3胸椎棘突下旁开约1.5 cm处)，置兔于特制兔笼，暴露针刺部位，常规剪毛备皮消毒，采用直径0.3 mm的一次性无菌针灸针，直刺进针5~7 mm，捻转1 min后接电针。使用G6805-1A低频电子脉冲治疗仪进行电针，针刺参数为[7, 8]：刺激时间9:00-11:00，30 min/次，1次/d，疏密波，频率2 Hz/100 Hz，波宽0.2~0.6 ms，刺激电流1~2 mA，刺激强度以兔肢体出现与电针频率一致的轻微颤动为宜。NA-EL组以相同的参数电针刺双侧足三里、内关和肺俞穴旁开0.5cm非经非穴处。
1.4 模型制备电针刺激5 d后，参照文献[9]介绍的方法制备内毒素休克诱发的急性肺损伤模型。实验前24 h禁食，可自由饮水。经兔耳缘静脉注射20%乌拉坦5 mL/kg麻醉后，仰卧位固定于自制兔台上。经耳缘静脉置管建立静脉输液通路，颈部备皮消毒后，0.8%利多卡因局麻下剪开颈部正中皮肤，分离气管行气管插管保证兔自主呼吸，分离右侧颈总动脉行颈总动脉置管，通过传感器与德国Hellige 监护仪相连接，持续监测动脉血压。待血压稳定后，G组、GL组、EGL组经耳缘静脉注入白屈菜红碱5 mg/kg(溶于0.1%二甲基亚砜0.5 mL)[10]，D组注入0.1%二甲基亚砜0.5 mL，其余组给予等容量的生理盐水。给予白屈菜红碱、二甲基亚砜或生理盐水30 min后ALI组、EL组、NA-EL组、GL组及EGL组经耳缘静脉注射LPS 5 mg/kg(溶于0.9%生理盐水2 mL)，其余3组予以同等剂量的生理盐水。给予LPS 后2 h内MAP下降量未达到基础值的25%或予LPS后 6 h内动物死亡者排除本实验。采集颈总动脉血样1 mL行血气分析，以PaO2/FiO2≤300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)为内毒素休克诱发急性肺损伤模型制备成功的标准[11]。
1.5 观测指标及方法 1.5.1 标本采集静脉注射LPS或生理盐水后6 h，取颈总动脉血置于促凝管中，3 000 r/min，4 ℃离心30 min，吸取上清液置于EP管中于-80 ℃低温冰箱保存。放血处死兔，留取双肺组织并用4 ℃磷酸盐缓冲盐水洗去表面血渍，将右肺中叶组织浸入10%甲醛溶液中固定，右肺下叶组织置于液氮罐中速冻后于冰箱-80 ℃保存。
1.5.2 肺组织湿/干质量比(W/D)取左肺上叶部分组织，纱布拭去表面水渍，于精细天平上称湿质量(W)，然后置于80 ℃干燥箱烘烤24 h后称干质量(D)，计算W/D比值，以肺组织湿/干质量比作为肺水肿的评价指标。
1.5.3 丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性取出-80 ℃保存的肺组织制备10%组织匀浆，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法测定，均参照试剂盒的操作步骤进行测定。
1.5.4 病理学观察及损伤评分取10%甲醛溶液固定的肺组织，经梯度乙醇脱水置换，二甲苯透明后，常规石蜡包埋，切片(厚度4 μm)，HE染色，每张切片随机选取10个视野于光学显微镜下观察(200×)，并依次进行肺组织损伤评分，取各组平均数作为各组总体的肺组织病理学评分。肺组织损伤的程度参照文献[12, 13]进行评分。
1.5.5 Western blot 法测定Nrf2总蛋白、核蛋白及PKC-α表达水平按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织蛋白，加入兔Nrf2多克隆抗体[3] (稀释度1∶ 1 000，Biorbyt公司，英国) 和兔PKC-α多克隆抗体(稀释度1∶ 1 000，Abcam公司，英国)，采用Quantity One凝胶成像分析系统进行扫描，以目的蛋白与内参β-actin两者条带积分吸光度值的比值反映Nrf2总蛋白、核蛋白及PKC-α蛋白的表达水平。
1.5.6 荧光定量PCR法测定Nrf2mRNA表达按试剂盒的操作步骤提取肺组织总RNA，按照逆转录试剂盒操作步骤逆转录合成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR。利用Primer Premier 5.0引物设计软件，根据美国国立生物技术信息中心公布的兔β-actin及Nrf2基因序列，设计β-actin Nrf2引物，通过NCBI中的Blast功能，初步检测引物的特异性。Nrf2上游引物：5’ -CCCACAAGTTCGGCA TCCAC-3’ ，下游引物：5’ -TGGCGATTCCTCTGGCGTCT-3’ ，片段长度182 bp (基因序列号：NM-001082274.1)； β-actin的上游引物：5’ - CGCGACATCAAGGA GAAGCTG-3’ ，下游引物：5’ -ATTGCCAATGGGTGATACCTG-3’ ，片段长度128 bp(基因序列号：AY598932)。采用20 μL PCR反应体系同时扩增Nrf2和β-actin，反应体系为：QuantiTectTM SYBR Green PCR mix 10μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-free ddH2O 6.0 μL；反应条件为：95 ℃ 15 min(预变性)，95 ℃20 s(变性)，60 ℃ 20 s(退火延伸)，40个循环。采用荧光定量PCR仪测定β-actin及Nrf2的Ct值，采用SDS软件以2-ΔΔCT法相对定量分析反映Nrf2 mRNA的水平[14, 15]。
1.6 统计学方法采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差( x±s )表示，组间比较采用单因素方差分析(LSD-t检验)；偏态分布的计量资料以中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验；以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肺损伤程度与C组比较，ALI组、EL组、NA-EL组、GL组及EGL组肺组织病理学评分升高 (P<0.05)，G组、D组差异无统计学意义(P>0.05)；与ALI组比较，EL组肺组织病理学评分降低(P<0.05)，GL组、EGL组肺组织病理学评分升高，NA-EL组差异无统计学意义(P>0.05)；与EL组比较，NA-EL组、EGL组肺组织病理学评分升高(P<0.05)；与EGL组比较，GL组肺组织病理学评分升高，(P<0.05)。见表 1。
| 组别 | 肺损伤程度评分 [M(P25，P75)] | W/D比率 ( x±s ) | MDA含量(nmol/mg，x±s ) | SOD活性(U/mg，x±s ) |
| C组 | 0(0) | 3.0±0.18 | 1.9±0.3 | 35±2.7 |
| D组 | 0(0) | 3.2±0.12 | 1.8±0.2 | 34±2.9 |
| G组 | 0(0) | 3.3±0.11 | 1.7±0.2 | 32±2.6 |
| ALI组 | 8.5(8,10)a | 6.8±0.23a | 4.7±0.6a | 19±1.2a |
| EL组 | 5(4,6)ab | 4.9±0.15ab | 3.2±0.4ab | 26±1.9ab |
| NA-EL组 | 9(8,10)ac | 6.5±0.21ac | 4.9±0.5ac | 18±1.3ac |
| GL组 | 13(11,14)abd | 8.6±0.42abd | 6.7±0.9abd | 6±0.5abd |
| EGL组 | 10.5(9,12)abc | 7.4±0.37abc | 5.9±0.7abc | 12±0.8abc |
| 注：与C组比较，aP<0.05;与ALI组比较，bP<0.05;与EL组比较，cP<0.05; 与EGL组比较，dP<0.05 | ||||
与C组比较，ALI组、EL组、NA-EL组、GL组及EGL组SOD活性活性降低，W/D、MDA含量升高，(P<0.05)，G组、D组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；与ALI组比较，EL组W/D、MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)，GL组、EGL组W/D、MDA含量升高，SOD活性下降(P<0.05)，NA-EL组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；与EL组比较，NA-EL组、EGL组W/D、MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；与EGL组比较，GL组W/D、MDA含量升高，SOD活性下降(P<0.05)。见表 1。
2.3 Nrf2核蛋白、总蛋白、PKC-α及Nrf2mRNA与C组比较，ALI组、EL组、NA-EL组、GL组及EGL组Nrf2 mRNA、PKC-α蛋白及Nrf2核蛋白和总蛋白表达水平均上调(P<0.05)，G组、D组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；与ALI组比较，EL组Nrf2mRNA、PKC-α、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平均上调(P<0.05)，GL组、EGL组Nrf2mRNA、PKC-α蛋白及Nrf2核蛋白和总蛋白表达水平均下调(P<0.05)，NA-EL组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；与EL组比较，NA-EL组、EGL组Nrf2mRNA、PKC-α蛋白及Nrf2核蛋白和总蛋白表达水平下调(P<0.05)；与EGL组比较，GL组Nrf2mRNA、PKC-α蛋白及Nrf2核蛋白和总蛋白表达水平均下调(P<0.05)。见表 2，图 1。
| 组别 | Nrf2核蛋白 | Nrf2总蛋白 | PKC-α | Nrf2mRNA |
| C组 | 0.26±0.05 | 1.15±0.08 | 0.32±0.06 | 1.02±0.07 |
| D组 | 0.28±0.06 | 1.13±0.09 | 0.31±0.05 | 1.03±0.08 |
| G组 | 0.27±0.05 | 1.14±0.09 | 0.32±0.05 | 1.01±0.09 |
| ALI组 | 0.97±0.14a | 2.18±0.27a | 0.85±0.12a | 2.09±0.27a |
| EL组 | 1.54±0.28ab | 2.76±0.38ab | 1.27±0.24ab | 3.43±0.39ab |
| NA-EL组 | 0.98±0.13ac | 2.19±0.26ac | 0.86±0.11ac | 2.08±0.25ac |
| GL组 | 0.56±0.07abd | 1.52±0.15abd | 0.49±0.07abd | 1.33±0.17abd |
| EGL组 | 0.77±0.11abc | 1.85±0.21abc | 0.68±0.09abc | 1.74±0.22abc |
| 注：与C组比较，aP<0.05;与ALI组比较，bP<0.05;与EL组比较，cP<0.05; 与EGL组比较，dP<0.05 | ||||
 |
| 图 1 Western blot检测各组兔肺组织Nrf2核蛋白、Nrf2总蛋白及PKC-α表达水平的比较 |
LPS可诱导多种炎性介质的过度表达，引起超活化系统性反应，最终导致多器官功能障碍综合征(MODS) [16]。本研究参照文献[8, 10]中介绍的方法，予耳缘静脉注射LPS 5 mg/kg (溶于0.9%生理盐水2 mL)，制备内毒素休克诱发急性肺损伤模型。MDA作为脂质过氧化反应的终产物之一，其含量可以反映氧自由基对机体细胞攻击的严重程度，可视为评判氧化应激的指标[17]。SOD具有氧自由基清除功能，是迄今为止发现的唯一以自由基为底物的酶，有极强的抗氧化作用，其活性水平能反映机体的抗氧化能力[18]。本研究结果发现，注射LPS后2 h内MAP下降量≥25%，且氧合指数≤300 mmHg，肺组织病理学损伤评分、W/D及MDA含量均升高,SOD活性降低，提示内毒素休克致急性肺损伤模型制备成功。
电针刺以传统针灸为基础，以毫针刺入腧穴得气后，针上通以脉冲电流，以设定强度、频率等方式行针治疗。针刺参数对电针刺激效果的影响至关重要，本研究参照文献[5, 6, 7]并结合前期实验研究设置电针参数，选择疏密波，针刺频率为2/100 Hz。内关穴属于厥阴心包经穴，肺俞穴属于足太阳膀胱经穴，足三里属于足阳明胃经穴，研究证实，电针刺上述三种穴位均可减轻内毒素休克造成的肺损伤，从而发挥对肺功能的保护作用[19]。本研究结果显示，经过电针刺激内毒素休克肺损伤兔双侧足三里、肺俞穴及内关穴处理，其W/D比值降低，肺组织病理学损伤评分降低，MDA含量减低，表明电针刺激穴位对兔内毒素休克致急性肺损伤有减轻作用。
Nrf2是调节抗氧化应激反应的关键性转录因子，在氧化应激状态下，Nrf2从胞浆蛋白Keap1中解离，易位至细胞核与抗氧化基因启动子区域的ARE结合，激活一系列Ⅱ相解毒酶如HO-1，CAT及GPx等的活性表达，从而增强抗氧化剂的作用以减轻外源性有毒物质对组织的损伤[20]。研究发现PKC、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol,PI3K)、等均参与Nrf2的活化，这些蛋白激酶通过直接磷酸化Nrf2促使其与Keap1分离，激活Nrf2[21] 。活化后的Nrf2转移入核，在核内与伴侣蛋白Maf、cJun、JunD等结合形成异二聚体后与ARE结合，启动受ARE调控的基因的转录，提高细胞抗氧化应激能力[22]。通过制备内毒素休克致急性肺损伤模型，本研究模拟了兔的氧化应激状态，结果表明，电针刺激穴位使Nrf2mRNA、Nrf2核蛋白及总蛋白表达上调，使内毒素休克致急性肺损伤程度减弱。
研究表明LPS与细胞膜上的受体结合可激活细胞内的多条信号转导通路，从而诱导细胞内多种炎性介质大量生成，PKC通路是其中一条[23]。PKC属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛存在于机体的组织细胞内，在某些条件下，它可通过磷酸化下游蛋白，诱导某些核转录因子的表达，进而发挥对细胞凋亡、炎症反应和氧化应激反应等的重要作用[24]。静止细胞中成熟的PKC主要存在细胞质中，细胞受刺激后，PKC从胞浆转移至胞膜活化[25]。PKC可通过直接磷酸化Nrf2使其与Keap1分离，并诱导其由胞浆转入胞核[26]。本研究表明，与EL组比较，EGL组肺组织病理学评分、W/D、MDA含量升高，SOD活性降低，提示加入PKC阻断剂后肺损伤程度加重；Nrf2mRNA、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平均下调则说明，加入PKC阻断剂后影响了电针上调Nrf2的表达。
综上所述，电针刺干预兔内毒素休克肺损伤中通过PKC介导上调Nrf2，进而发挥肺保护作用，这将为临床上内毒素休克致肺损伤的防治提供新的思路和理论依据。
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