中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (5): 508-511
转染HO-1对酒精诱导的成骨细胞损伤的保护作用
李杰, 张丰泉 , 刘涛, 杜振宁, 蔡腾    
450003 郑州,河南省人民医院急诊科(李杰、刘涛、杜振宁、蔡腾);
450003 郑州,新乡医学院公共卫生学院(张丰泉)

血红素加氧酶1(HO-1)属于一种热休克蛋白,是血红素分解的限速酶,能将血红素分解为胆绿素、CO和NO等,能够被多种氧化应激因素和细胞因子激活,在体内具有抗氧化、抗炎症反应和免疫调节等重要作用[1],对动植物均具有保护作用。大量临床研究证实长期过量酒精暴露的人群,其发生骨代谢紊乱、骨质疏松或股骨头坏死的概率明显高于正常人群[2, 3]。另有研究发现酒精能够增加骨折发生的风险并且减缓骨折的愈合[4]。近年有研究发现酒精对骨代谢的影响与酒精引起的氧化应激反应[5, 6]有密切关系。因而本次研究尝试将人HO-1转染进入体外培养的人成骨细胞中,观察转染HO-1基因后人成骨细胞对酒精的耐受性及细胞分泌BMP-2和TGF-β1水平的影响,从而为HO-1能否用作治疗酒精性骨代谢疾病的生物制剂提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)、MTT(Sigma公司),Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天),HO-1真核表达质粒(Biovector Science Lab),MDA、ROS检和SOD检测试剂盒(碧云天),BMP-2和TGF-β1 ELISA检测试剂盒(R&D Systems,Inc.),Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences),723分光光度计(上海光谱仪器有限公司),Sunrise酶标仪(Tecan公司),930A荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)。

1.2 实验方法 1.2.1 人成骨细胞的分离培养

参照杨玉生等[7]的方法分离培养正常人成骨细胞。将分离的成骨细胞充分打散后悬于DMEM培养液(含10%胎牛血清)中置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,隔天换液。

1.2.2 人成骨细胞HO-1转染和实验分组

取对数生长期细胞,调整细胞浓度为1×104/mL接种于96孔板中,当细胞铺满>80%时,按照Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒说明进行操作,设置空白对照组(未转染)、100 nmol/L HO-1质粒转染组,每组设6个平行样。转染24 h后,荧光显微镜下观察转染效果。实验中设置阴性对照组(不加酒精、未转染HO-1),阳性对照组(加100 mmol/L酒精、未转染HO-1)和HO-1转染组(加100 mmol/L酒精、转染HO-1),实验中酒精浓度参考文献[5]。

1.2.3 MTT检测细胞活性

各组细胞酒精暴露24 h后,每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT,继续培养4 h,弃上清液,加150 μL DMSO,室温下震荡10 min,用酶标仪于490 nm测定各孔的吸光度值(OD值)。细胞活性=(实验组OD值/阴性对照组OD值)×100%。

1.2.4 细胞中ROS测定

调整细胞浓度至2×105/mL,接种于已放有灭菌盖玻片的6孔板中,细胞转染及分组情况同1.2.2。酒精作用24 h后,PBS缓冲液漂洗盖玻片2次,按照ROS检测试剂盒说明进行操作,荧光分光光度计测定各组细胞的荧光强度。

1.2.5 细胞中MDA和SOD含量的测定

调整细胞浓度至1×106/mL,接种于6孔板中,细胞转染和分组同1.2.2。酒精作用24 h后,首先收集细胞培养液上清液用于BMP-2和TGF-β1的检测,然后收集细胞并超声粉碎细胞,提取细胞蛋白。按照MDA和SOD试剂盒说明分别检测细胞中MDA和SOD的含量。

1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中BMP-2和TGF-β1

将1.2.5中收集的细胞上清液采用双抗体夹心酶联免疫法检测细胞分泌的 BMP-2和TGF-β1。严格按照试剂盒说明配制标准品及样品,用酶标仪测定各样品的吸光度值,并计算细胞中BMP-2和TGF-β1相应的含量。

1.3 统计学方法

计量资料均以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS 13.0进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两组间比较时,方差齐采用SNK法,方差不齐采用Games-Howell法。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 转染HO-1后成骨细胞形态

转染HO-1质粒24 h后,荧光显微镜下观察成骨细胞形态,可见成骨细胞正常贴壁生长,细胞呈多边形,四周有多个突起,荧光物质均匀分布于成骨细胞胞浆中,见图 1

图 1 转染HO-1成骨细胞形态(×200)
2.2 细胞活性检测结果

100 mmol/L酒精作用24 h,阳性对照组和HO-1转染组的相对细胞活性为(40.33±9.18)%和(67.35±6.90)%。与阴性对照组相比,酒精作用后阳性对照组和HO-1转染组细胞活性均明显降低(P < 0.05)。但HO-1转染组相对细胞活性明显高于阳性对照组细胞活性,差异具有统计学意义(P < 0.05),见图 2

与阴性对照组相比较,aP < 0.05;与阳性对照组相比较,bP < 0.05 图 2 细胞活性检测结果
2.3 细胞中ROS、SOD和MDA检测结果

酒精作用成骨细胞24 h,细胞中ROS、 SOD和MDA的含量变化见表 1。100 mmol/L酒精作用于成骨细胞后,ROS和MDA含量均较阴性对照组明显升高(P < 0.05),而SOD活力单位比阴性对照组明显降低(P < 0.05)。

表 1 酒精作用后细胞中ROS、SOD和MDA的含量
(n=6,x±s)
组别ROS(μmol/L)SOD(U/mg prot)MDA(mol/mg prot)
阴性对照组0.13±0.0117.52±0.530.10±0.02
阳性对照组0.71±0.02 a6.06±0.42 a0.70±0.16 a
HO-1组0.43±0.13 ab11.59±1.06ab0.41±0.08 ab
 注:与阴性对照组比较,aP < 0.05;与阳性对照组比较,bP < 0.05

当酒精作用于转染HO-1成骨细胞后,虽然ROS、 SOD和MDA变化与阳性对照组相似(与阴性对照组相比),但与阳性对照组相比,ROS和MDA升高量明显降低,SOD活力明显升高(P < 0.05)。

2.4 细胞中BMP-2和TGF-1含量检测结果

与阴性对照组相比,阳性对照组和HO-1转染组酒精作用24 h,细胞中BMP-2和TGF-β1水平均升高,差异有统计学意义(P < 0.05)。与阳性对照组相比,酒精作用后HO-1转染组细胞中BMP-2和TGF-β1水平明显降低(P < 0.05),见表 2

表 2 细胞中BMP-2和TGF-β1含量
(ng/L,n=6,x±s)
组别BMP-2 TGF-β1
阴性对照组68.50±4.12451.83±6.44
阳性对照组23.20±5.79a217.52±3.98a
HO-1组47.41±3.58 ab355.62±7.07 ab
 注:与阴性对照组比较,aP < 0.05;与阳性对照组比较,bP < 0.05
3 讨论

虽然适量的饮酒对骨代谢是有益处的[8],但长期过量饮酒则能引起机体骨质丢失,且研究证实饮酒已成为骨质疏松和股骨头坏死的重要危险因素[2]。酒精对骨代谢的机制主要包括:(1)酒精能够抑制成骨细胞的活性和增殖,同时还能抑制其前体细胞形成[9];(2)酒精能诱导骨髓基质细胞分化为脂肪细胞,减少成骨细胞的分化[10],即酒精致骨髓基质细胞成脂分化学说;(3)酒精能干扰体内其他激素的活性,如PTH、糖皮质激素等。

HO是广泛存在于动植物体内的微粒体酶系统,参与多种生理病理过程,包括三种同工酶HO-1、HO-2和HO-3。HO-1为诱导性,能被氧化应激和炎性反应因子等激活,具有非常强的抗氧化损伤、抗炎症反应和免疫调节能力[1]。有研究发现HO-1不仅能够诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞[11],而且HO-1能够通过抑制巨噬细胞集落刺激因子受体c-fms而抑制破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞,从而减少骨吸收[12]。本实验中,笔者利用基因转染技术将HO-1转染到人成骨细胞中,使细胞中HO-1特异性高表达,从而观察其对酒精损伤作用的耐受性,研究特异转染HO-1是否能够对酒精诱导的成骨细胞损伤有抑制作用。本次研究中MTT结果显示,与阴性对照组细胞相比,虽然HO-1转染组细胞活性也明显降低,其细胞活性却明显高于阳性对照组细胞活性。由此可见,当人成骨细胞转染HO-1后,细胞抵抗酒精损伤的能力明显增强。据此笔者推测,HO-1特异性高表达后能够有效抑制酒精对成骨细胞的损伤作用,对成骨细胞起到保护作用。

成骨细胞能够分泌骨形成蛋白(BMP)和转化生长因子-β(TGF-β),在骨的形成和修复中起重要作用[13]。其中TGF-β1与骨的代谢关系最密切,调控骨髓间充质干细胞的增殖并诱导其向成骨细胞分化。BMP-2具有较强的诱导成骨细胞分化能力,也能够诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,是公认的高效的成骨诱导因子[14]。有研究发现骨折4周后,骨痂中BMP-2和TGF-β的表达量均已明显降低,进而延缓骨折的修复和愈合,由此可见骨折后,BMP-2和TGF-β表达过低是导致骨质疏松骨折愈合缓慢的可能原因之一[15]。本次实验结果显示,转染HO-1组成骨细胞中的BMP-2和TGF-β1表达量明显高于阳性对照组。这一结果表明,转染HO-1不仅可以增强酒精作用后成骨细胞的活性,同时还能使成骨细胞中BMP-2和TGF-β1增加。笔者推测转染HO-1可以加速酒精诱导的骨质疏松和骨折的愈合,但还有待进一步的实验证明。

氧化应激是机体内氧化与抗氧化作用的失衡,能够对机体造成脂质过氧化、DNA氧化损伤等危害。ROS是引起机体发生氧化应激的重要氧化物质,MDA则是脂质过氧化的终产物,而SOD则是机体重要的抗氧化酶。这些物质的变化能够直接反映机体氧化平衡状态。已有的研究表明大量的酒精能够使机体氧化水平升高,而抗氧能力下降,当抑制体内氧化物质形成时,则能改善酒精引起的骨损伤作用[3]。HO具有较强的抗氧化作用,因而当机体内发生氧化应激反应时,HO系统被激活而发挥抗氧化作用,减少氧化应激反应对机体的损伤。本次研究结果显示,当酒精作用于成骨细胞后,阳性对照组成骨细胞中的ROS和MDA含量明显高于阴性对照组,本次实验结果证实酒精能够诱导成骨细胞发生氧化应激反应,与以往的研究相一致[5]。但本次实验中HO-1转染组成骨细胞中ROS和MDA含量明显低于阳性对照组,而SOD含量则明显高于阳性对照组,由此可见转染HO-1能够明显地抑制酒精诱导的成骨细胞氧化应激反应,对成骨细胞起到保护作用。

总之,本次实验结果表明,转染HO-1能够增强酒精作用后成骨细胞的活性,对成骨细胞有保护作用。其保护作用机制可能与HO-1抑制酒精诱导的成骨细胞氧化应激反应有关。另外HO-1转染后成骨细胞BMP-2和TGF-β1的分泌的量明显增加,增强间充质细胞成骨分化,进而提高机体对酒精造成的骨损伤的修复能力。

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