Shen Jie, Email: j1999sh@163.com
脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)导致血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的破坏以及通透性的增加,从而造成脑水肿及脑损伤 [1]。脑缺血-再灌注时血脑屏障通透性的变化,以及可能的保护机制对脑缺血-再灌注的临床治疗具有重要意义。研究表明缺血-再灌注后,大鼠脑水肿迅速发生,血脑屏障开放[2]。醒脑静(XNJ)是在安宫牛黄丸的基础上精制而成的一种中药注射液,主要配方为麝香、郁金、冰片、栀子,具有清热解毒、凉血活血、开窍醒脑之效,对于脑缺血-再灌注损伤有很好的疗效[3],但对其治疗机制并未进行深入研究。本研究从脑缺血-再灌注损伤后脑毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)的主要结构质膜微囊(caveolae)入手,探讨醒脑静对血脑屏障的影响,尤其是对血脑屏障质膜微囊中的标志性蛋白Caveolin-1 (CAV-1)[4]的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组健康成年雄性Wistar 大鼠162只,体质量200~250 g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。购自第二军医大学实验动物中心。在标准动物饲养间内,室温保持在24~26 ℃,每12 h光、暗交替,给予无菌水和食物饲养,自主获得食物和水。随机(随机数字法)分为3组,每组54只,即假手术组(Sham组);全脑缺血-再灌注模型组(Model组);全脑缺血-再灌注+醒脑静干预组(XNJ组)。每组又分3个时间点观察:再灌注后24、48和72 h,每个观察时点18只,分别进行脑组织中水含量测定、伊文氏蓝染色及CAV-1蛋白检测。
1.1.2 主要试剂与设备醒脑静注射液(XNJ,无锡济民可信山禾药业股份有限公司产品,国药准字:Z32020564,批号:130625);伊文氏蓝(Evan blue,EB,Sigma公司,美国),CAV-1一抗(Abcam公司,美国),BIOTEK酶标仪Epoch(BioTek 公司,美国)。
1.2 方法 1.2.1 大鼠全脑缺血-再灌注模型的制备采用改良Pulsinelli四血管闭塞法[5]。10%水合氯醛麻醉,大鼠固定于操作台,颈后备皮、消毒,于第1颈椎水平作1~2 cm的纵形切口,分离筋膜、肌肉,暴露第1颈椎翼突孔,电凝双侧椎动脉造成椎动脉永久性闭塞,消毒缝合切口。翻转大鼠仰卧位固定,于颈前正中作切口,分离双侧颈总动脉,穿线打一活结埋于皮下备用,消毒缝合。24 h后不行麻醉固定,用无损伤微动脉夹夹闭双侧颈总动脉持续10 min,造成大鼠全脑缺血。出现瞳孔散大、翻正反射消失立即撤去动脉夹恢复脑血流,消毒缝合切口。
1.2.2 给药模型完成后,XNJ组立即腹腔注射醒脑静注射液10 mL/(kg·d) ,Model组则给予等体积生理盐水进行腹腔注射干预,Sham组完成切口,分离但不结扎和凝闭血管。
1.2.3 干湿质量法测定脑组织中水含量[6]各组大鼠麻醉后,立即断头取脑,经电子天平精确称重后,放入 110 ℃恒温干燥箱烘烤 24 h至恒重(两次称质量差<0.2 mg)后,用同一电子天平再精确称干脑组织质量,并按照 Eliot干湿质量法计算脑组织含水量,以百分率表示。脑含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。
1.2.4 伊文氏蓝染色检测血脑屏障通透性参照文献[7]的方法进行,从大鼠尾静脉注入2 %的EB溶液(5 mL/kg体质量),5 h后麻醉左心室灌注生理盐水300 mL,取脑,做2 mm厚冠状切片,并用电子天平分别精确称其湿质量后,置于二甲基甲酰胺溶液,60 ℃水浴48 h取出,5 000 r/min离心取上清液,并再次离心取上清液,200 μL加入酶标板中,酶标仪632 nm测定吸光度。标准曲线制作:称取EB 4 mg,加生理盐水至总容积25 mL,取0.3 mL加入5.7 mL二甲基甲酰胺中混匀作为第1管;再从第1管中取3 mL加入3 mL二甲基甲酰胺作为第2管;照此类推共作6管。其质量浓度依次为8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。水浴孵育48 h后比色(λ=632 nm)测定吸光度,制作出其标准曲线。
1.2.5 Western blot 检测CAV-1蛋白含量各组大鼠麻醉取脑后,取皮层脑组织匀浆后提取总蛋白,测浓度后,进行SDS-PAGE凝胶电泳,然后转膜,经兔抗鼠一抗孵育后,加二抗孵育,化学发光后压片曝光,SYNGENE生物图像系统拍照及数据处理
1.3 统计学方法计量资料以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS 13.0软件进行统计,采用单因素方差分析(one way ANOVA),组间两两比较采用SNK-q检验,以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 脑组织中的水含量各组大鼠在缺血-再灌注后24、48和72 h,以干湿质量法测定脑组织中含水量,以了解脑组织的水肿程度。结果表明,缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组的脑组织含水量均高于Sham组,且差异有统计学意义(P < 0.05)。缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织含水量开始显著高于Sham组和XNJ组,且差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
(%,x±s) | ||||
组别 | n | IS后 24 h | IS后48 h | IS后72 h |
Sham组 | 6 | 72.33±0.67a | 72.67±1.26a | 70.00±0.73a |
Model组 | 6 | 83.33±1.56 | 80.50±1.26 | 77.00±1.15 |
XNJ组 | 6 | 83.00±1.46 | 75.00±1.06a | 72.17±0.75a |
注:与Model组比较,aP < 0.05 |
EB在正常情况下与血浆白蛋白结合不能着色;当脑缺血-再灌注损伤后由于BBB破坏,通透性增加,EB会通过血管壁进入脑组织而着色,因此EB可作为示踪剂对BBB破坏进行定量评价。实验结果显示Model组和XNJ组均有EB的渗漏,说明均有血脑屏障的破坏。在缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组大鼠脑组织内EB含量均显著高于Sham组(P < 0.05)。缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织内EB含量显著高于Sham组和XNJ组(P < 0.05),且XNJ组又显著高于Sham组(P < 0.05),见图 1。
2.3 缺血-再灌注后24、48、72 h后各组大鼠皮层中CAV-1表达情况如图 2所示,缺血-再灌注后24、48、72 h,Model组和XNJ组大脑皮层中的CAV-1蛋白表达水平显著低于Sham组,差异有统计学意义(P < 0.05);随再灌注时间的延长,再灌注后24、48、72 h三个时间点,XNJ组的CAV-1蛋白表达水平逐渐增加,与Model组相比,XNJ组CAV-1蛋白表达水平显著增加(P < 0.05)。但仍显著低于Sham组(P < 0.05),见图 2,3。
3 讨论血脑屏障(BBB) 是主要由脑毛细血管内皮细胞、细胞间紧密连接(tight junction,TJ)、连续的基底膜和基底外侧的星型胶质细胞终足等结构构成,并保持中枢神经系统内环境的相对稳定[8]。脑缺血-再灌注可导致血脑屏障破坏,通透性增加,炎性因子及有害物质进入脑组织,引起脑水肿形成,从而加重脑损伤。脑缺血发生的时候,伊文氏蓝出现在缺血区,表明BBB通透性增加;脑组织相对含水量可用于估计大鼠脑水肿的程度。张红波等[9]通过腹腔注射醒脑静小剂量组(3.33 mL/kg)、中剂量组(6.66 mL/kg)、大剂量组(10 mL/kg)初步观察发现,醒脑静注射液对脑组织的保护作用存在较明显的量效关系。本实验采用腹腔注射醒脑静注射液10 mL/(k g·d),结果显示,大鼠全脑缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组的脑组织含水量均显著高于Sham组(P < 0.05),但在缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织含水量显著高于XNJ组和Sham组(P < 0.05)。缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组大鼠脑组织内伊文氏蓝(EB)含量均高于Sham组(P < 0.05),缺血-再灌注后48 h和72 h,Sham组和XNJ组的EB含量显著低于Model组(P < 0.05)。提示全脑缺血-再灌注后出现脑水肿和血脑屏障的通透性增加,醒脑静有稳定血脑屏障通透性、减轻脑水肿的作用。
物质通过BBB的途径一般有细胞旁路和跨细胞途径两种。血管内皮细胞结构主要由质膜微囊和紧密连接构成,是BBB的基础,是阻止血浆蛋白进入大脑的主要成分,对BBB通透性的改变起着主要作用。Caveolae 的主要功能是介导跨细胞的内吞转运,另外还可能具有信号转导、细胞生长与凋亡及其他功能[4]。Caveolin-1(CAV-1)是一个整合膜蛋白(相对分子质量为21 000~24 000),是Caveolae的主要结构成分,是脑损伤后大分子物质通过跨膜传导作用进入内皮间隙,导致BBB功能紊乱的关键环节[10]。实验研究证实,许多大分子物质的跨细胞转运是通过CAV-1介导的胞吞途径来实现的,如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、低密度脂蛋白等[11]。Shen等[12]研究发现脑缺血-再灌注损伤引起CAV-1表达减少,下调CAV-1的表达引起血脑屏障的破坏,脑缺血所产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)能下调CAV-1的表达,而CAV-1的下调,能引起一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的增加,促进生成更多的NO。Gu等[13]则进行了系列研究,关注了脑缺血缺氧期CAV-1与金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)之间的相关性,提示缺血-再灌注损伤能下调离体培养的皮质微血管区、海马和皮质CAV-1的表达,认为脑缺血-再灌注损伤时活性氮、CAV-1、MMPs间的相互作用是BBB紊乱和梗死面积增加的主要原因;CAV-1能够调节NOS和MMP的活性以及BBB通透,活性氮与CAV-1互相作用,形成了一个反馈回路,通过激活MMPs而造成血脑屏障的不断破坏。脑脊液中和血液检测单一蛋白质有一定局限性,但结合现有技术,分析标志物变化,对判断脑损伤程度,评估预后,调整治疗方案有重要意义[14]。实验通过Western blot检测CAV-1蛋白的表达显示,缺血-再灌注后24、48、72 h,Model组和XNJ组大脑皮层中的CAV-1蛋白表达水平显著低于Sham组,随再灌注时间的延长,XNJ组的CAV-1蛋白表达水平逐渐增加,与Model组相比,XNJ组CAV-1蛋白表达水平增加显著(P < 0.05)。提示全脑缺血再灌后CAV-1蛋白表达水平下调,醒脑静能使表达下调的CAV-1蛋白显著升高,起到了保护BBB的作用,这可能是醒脑静注射液发挥对脑缺血-再灌注后BBB保护作用的机制之一。
醒脑静注射液是临床常用的中成药急救药品,该药具有醒脑开窍、清热凉血、行气活血和解热止痛等功效,静脉给药后可通过血脑屏障直接作用于中枢神经系统,具有兴奋中枢、解热、镇痛、抑菌、抗炎、保肝的药效[15]。本实验表明,醒脑静能调节CAV-1蛋白的表达,稳定血脑屏障通透性及减轻脑水肿。
[1] | Kiening KL,Van landeghem FKH,Schreiber S, et al. Decreased hemispheric Aquaporin-4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats [J]. Neurosci Lett,2002,324(2):105-108. |
[2] | 王姗姗, 陈寿权, 李章平, 等.乌司他丁对心肺复苏后大鼠脑水肿和血脑屏障的作用[J].中华急诊医学杂志,2006,15(4):338-341. |
[3] | 李芳君,谢少玲.醒脑静注射液对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用[J].中药材,2011,34(7):1111-1113. |
[4] | Virgintino D,Robertson D,Errede M, et al. Expression of caveolin-1 in human brain microvessels[J]. Neuroscience, 2002,115(1):145-152. |
[5] | Pulsinelli WA,Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat [J]. Stroke,1979,10(3):267-272. |
[6] | Ren C,Gao M,Dornbos D, et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury[J]. Neurol Res, 2011,33(5):514-519. |
[7] | Huang P,Zhou CM,Qin H, et al. Cerebralcare Granule attenu-ates blood-brain barrier disruption after middle cerebral artery occlusion in rats [J]. Exp Neurol,2012 ,237(2):453-463. |
[8] | Mark KS,Davis TP. Cerebral microvascular changes in perm-eability and tight junctions induced by hypoxia-reoxygenation [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002,282(4):H1485-1494. |
[9] | 张红波,代建,张宾辉. 醒脑静注射液对脑缺血-再灌注氧化损伤的实验研究[J].浙江中医药大学学报,2006,30(3):233-237. |
[10] | Xia C, Zhang Z, Xue Y, et al. Mechanisms of the increase in the permeability of the blood-tumor barrier obtained by combining low-frequency ultrasound irradiation with small-dose bradykinin[J]. J Neurooncol,2009,94(1):41-50. |
[11] | Mehta D,Bhattacharya J,Matthay MA,et al. Integrated control of lung fluid balance[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004,287(6):L1081-L1090. |
[12] | Shen JG,Ma S,Chan PS,et al. Nitric oxide down-regulates caveolin-1 expression in rat brains during focal cerebral ischemia and reperfusion injury[J]. J Neurochem,2006,96(4):1078-1089. |
[13] | Gu Y,Zheng GQ,Xu MJ,et al. Caveolin-1 regulates nitric oxide-mediated matrix metalloproteinases activity and blood-brain barrier permeability in focal cerebral ischemia and reperfusion injury [J]. J Neurochem,2012,120(1):147-156. |
[14] | 刁孟元, 林兆奋. 心肺复苏后脑损伤生化标志物研究进展[J].中华急诊医学杂志,2013,22(8): 938-940. |
[15] | 张路晗,向金莲,程睿,等.醒脑静注射液的药效学研究[J].华西药学杂志,2001,16(6):429-431. |