中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (5): 501-505
醒脑静注射液对全脑缺血-再灌注大鼠脑内Caveolin-1表达的影响
陈俊峰, 李炳, 刘明, 李宏治, 梁晓俊, 申捷 , 钟志越     
201508 上海,复旦大学附属附属金山医院化学伤害救治中心重症监护室
摘要目的 探讨醒脑静注射液对大鼠全脑缺血-再灌注后血脑屏障通透性及血脑屏障质膜微囊(Caveolae)中的标志性蛋白Caveolin-1的影响。 方法 采用改良Pulsinelli四血管闭塞法建立大鼠全脑缺血-再灌注模型。将162只雄性Wistar大鼠随机(随机数字法)分为3组,即假手术组(Sham组)、全脑缺血-再灌注模型组(Model组)和醒脑静组(XNJ组)。每组又分别于缺血-再灌注后24、48和72 h三个时间点观察。用干湿重法测定脑组织中水含量,分光光度计法检测脑组织伊文氏蓝含量,Western blot检测大脑皮层的Caveolin-1蛋白含量。 结果 缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组的脑组织含水量均显著高于Sham组(P < 0.05),但在缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织含水量显著高于XNJ组和Sham组(P < 0.05)。缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组大鼠脑组织内伊文氏蓝(EB)含量均高于Sham组(P < 0.05),缺血-再灌注后48 h和72 h,Sham组和XNJ组的EB含量显著低于Model组(P < 0.05)。缺血-再灌注后24、48和72 h,Model组和XNJ组脑皮层中的Caveolin-1蛋白表达水平显著低于Sham组,差异有统计学意义(P < 0.05);但是XNJ组在缺血-再灌注后三个时间点,Caveolin-1蛋白表达水平显著高于Model组(P < 0.05)。 结论 在脑缺血-再灌注后,醒脑静注射液对血脑屏障具有保护作用,可能与醒脑静注射液调节血脑屏障质膜微囊(Caveolae)中的标志性蛋白Caveolin-1的表达有关。
关键词醒脑静注射液     缺血缺氧          血脑屏障     Caveolin-1     脑水肿    
The effects of Xingnaojing injection on Caveolin-1 in cortex of brain after global ischemia-reperfusion
Chen Junfeng, Li Bing, Liu Ming, Li Hongzhi, Liang Xiaojun, Shen Jie , Zhong Zhiyue     
Center of Emergency & Intensive Care Unit Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China.
Corresponding author: Zhong Zhiyue, Email:zzy1388@aliyun.com;
Shen Jie, Email: j1999sh@163.com
Abstract: Objective To study the impact of Xingnaojing (XNJ) injection (a preparation of Chinese herb medicine) on the permeability of blood-brain barrier and Caveolin-1 in cortex of brain after global ischemia-reperfusion. Methods Modified Pulsinelli method for four-vessel occlusion was employed to establish the global ischemia reperfusion model in rats. Male Wistar rats were randomly(random number) divided into three groups, namely sham group, model group and XNJ group. Each group was observed at 24 h, 48hand 72hafter ischemia reperfusion. The water content of brain tissue was determined by dry/wet weight ratio, while the Evans blue (EB) concentration in brain tissue was detected by spectrophotometer. Western blot was used to detect caveolin-1 level in the cerebral cortex. Results The water contents of brain tissue in model group and XNJ group were significantly higher than that in sham group 24 hour after ischemia-reperfusion (P < 0.05). But at 48hand 72hafter ischemia-reperfusion, the brain water content in model group was significantly higher than that in XNJ group and sham group (P < 0.05). The EB concentrations in brain tissue in model group and XNJ group were higher than that in sham group 24hafter ischemia-reperfusion (P < 0.05). EB levels in sham group and XNJ group were significantly lower than that in model group 48hand 72hafter ischemia-reperfusion (P < 0.05). Caveolin-1 levels in cerebral cortex in sham group and XNJ group were significantly higher than that in model group 24 h, 48hand 72hafter ischemia-reperfusion (P < 0.05). Conclusions After global ischemia-reperfusion, Xingnaojing (XNJ) injection could protect blood-brain barrier in virtue of regulating caveolin-1 protein level.
Key words: Xingnaojing injection     Cerebral ischemia hypoxia     Brain     Blood-brain barrie     Caveolin-1     Brain edema    

脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)导致血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的破坏以及通透性的增加,从而造成脑水肿及脑损伤 [1]。脑缺血-再灌注时血脑屏障通透性的变化,以及可能的保护机制对脑缺血-再灌注的临床治疗具有重要意义。研究表明缺血-再灌注后,大鼠脑水肿迅速发生,血脑屏障开放[2]。醒脑静(XNJ)是在安宫牛黄丸的基础上精制而成的一种中药注射液,主要配方为麝香、郁金、冰片、栀子,具有清热解毒、凉血活血、开窍醒脑之效,对于脑缺血-再灌注损伤有很好的疗效[3],但对其治疗机制并未进行深入研究。本研究从脑缺血-再灌注损伤后脑毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)的主要结构质膜微囊(caveolae)入手,探讨醒脑静对血脑屏障的影响,尤其是对血脑屏障质膜微囊中的标志性蛋白Caveolin-1 (CAV-1)[4]的影响。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组

健康成年雄性Wistar 大鼠162只,体质量200~250 g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。购自第二军医大学实验动物中心。在标准动物饲养间内,室温保持在24~26 ℃,每12 h光、暗交替,给予无菌水和食物饲养,自主获得食物和水。随机(随机数字法)分为3组,每组54只,即假手术组(Sham组);全脑缺血-再灌注模型组(Model组);全脑缺血-再灌注+醒脑静干预组(XNJ组)。每组又分3个时间点观察:再灌注后24、48和72 h,每个观察时点18只,分别进行脑组织中水含量测定、伊文氏蓝染色及CAV-1蛋白检测。

1.1.2 主要试剂与设备

醒脑静注射液(XNJ,无锡济民可信山禾药业股份有限公司产品,国药准字:Z32020564,批号:130625);伊文氏蓝(Evan blue,EB,Sigma公司,美国),CAV-1一抗(Abcam公司,美国),BIOTEK酶标仪Epoch(BioTek 公司,美国)。

1.2 方法 1.2.1 大鼠全脑缺血-再灌注模型的制备

采用改良Pulsinelli四血管闭塞法[5]。10%水合氯醛麻醉,大鼠固定于操作台,颈后备皮、消毒,于第1颈椎水平作1~2 cm的纵形切口,分离筋膜、肌肉,暴露第1颈椎翼突孔,电凝双侧椎动脉造成椎动脉永久性闭塞,消毒缝合切口。翻转大鼠仰卧位固定,于颈前正中作切口,分离双侧颈总动脉,穿线打一活结埋于皮下备用,消毒缝合。24 h后不行麻醉固定,用无损伤微动脉夹夹闭双侧颈总动脉持续10 min,造成大鼠全脑缺血。出现瞳孔散大、翻正反射消失立即撤去动脉夹恢复脑血流,消毒缝合切口。

1.2.2 给药

模型完成后,XNJ组立即腹腔注射醒脑静注射液10 mL/(kg·d) ,Model组则给予等体积生理盐水进行腹腔注射干预,Sham组完成切口,分离但不结扎和凝闭血管。

1.2.3 干湿质量法测定脑组织中水含量[6]

各组大鼠麻醉后,立即断头取脑,经电子天平精确称重后,放入 110 ℃恒温干燥箱烘烤 24 h至恒重(两次称质量差<0.2 mg)后,用同一电子天平再精确称干脑组织质量,并按照 Eliot干湿质量法计算脑组织含水量,以百分率表示。脑含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.2.4 伊文氏蓝染色检测血脑屏障通透性

参照文献[7]的方法进行,从大鼠尾静脉注入2 %的EB溶液(5 mL/kg体质量),5 h后麻醉左心室灌注生理盐水300 mL,取脑,做2 mm厚冠状切片,并用电子天平分别精确称其湿质量后,置于二甲基甲酰胺溶液,60 ℃水浴48 h取出,5 000 r/min离心取上清液,并再次离心取上清液,200 μL加入酶标板中,酶标仪632 nm测定吸光度。标准曲线制作:称取EB 4 mg,加生理盐水至总容积25 mL,取0.3 mL加入5.7 mL二甲基甲酰胺中混匀作为第1管;再从第1管中取3 mL加入3 mL二甲基甲酰胺作为第2管;照此类推共作6管。其质量浓度依次为8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。水浴孵育48 h后比色(λ=632 nm)测定吸光度,制作出其标准曲线。

1.2.5 Western blot 检测CAV-1蛋白含量

各组大鼠麻醉取脑后,取皮层脑组织匀浆后提取总蛋白,测浓度后,进行SDS-PAGE凝胶电泳,然后转膜,经兔抗鼠一抗孵育后,加二抗孵育,化学发光后压片曝光,SYNGENE生物图像系统拍照及数据处理

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS 13.0软件进行统计,采用单因素方差分析(one way ANOVA),组间两两比较采用SNK-q检验,以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 脑组织中的水含量

各组大鼠在缺血-再灌注后24、48和72 h,以干湿质量法测定脑组织中含水量,以了解脑组织的水肿程度。结果表明,缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组的脑组织含水量均高于Sham组,且差异有统计学意义(P < 0.05)。缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织含水量开始显著高于Sham组和XNJ组,且差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1

表 1 在缺血-再灌注(IS)后24、48、72 h各组大鼠脑组织中含水量变化Table 1 The change of water content in brain tissue of rats 24, 48 and 72hafter ischemia reperfusion
(%,x±s)
组别nIS后 24 hIS后48 hIS后72 h
Sham组672.33±0.67a72.67±1.26a70.00±0.73a
Model组683.33±1.5680.50±1.2677.00±1.15
XNJ组683.00±1.4675.00±1.06a72.17±0.75a
 注:与Model组比较,aP < 0.05
2.2 伊文氏蓝(EB)染色及EB含量测定

EB在正常情况下与血浆白蛋白结合不能着色;当脑缺血-再灌注损伤后由于BBB破坏,通透性增加,EB会通过血管壁进入脑组织而着色,因此EB可作为示踪剂对BBB破坏进行定量评价。实验结果显示Model组和XNJ组均有EB的渗漏,说明均有血脑屏障的破坏。在缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组大鼠脑组织内EB含量均显著高于Sham组(P < 0.05)。缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织内EB含量显著高于Sham组和XNJ组(P < 0.05),且XNJ组又显著高于Sham组(P < 0.05),见图 1

与Sham组比较,aP < 0.05;与Model组比较,bP < 0.05 图 1 缺血-再灌注后24、48、72 h各组大鼠脑组织中EB质量分数变化 Fig 1 Change of EB concentration in brain tissue of rats 24 h, 48 hand 72 hafter ischemia reperfusion
2.3 缺血-再灌注后24、48、72 h后各组大鼠皮层中CAV-1表达情况

图 2所示,缺血-再灌注后24、48、72 h,Model组和XNJ组大脑皮层中的CAV-1蛋白表达水平显著低于Sham组,差异有统计学意义(P < 0.05);随再灌注时间的延长,再灌注后24、48、72 h三个时间点,XNJ组的CAV-1蛋白表达水平逐渐增加,与Model组相比,XNJ组CAV-1蛋白表达水平显著增加(P < 0.05)。但仍显著低于Sham组(P < 0.05),见图 23

图 2 缺血-再灌注后24、48、72 h各组大鼠脑皮层中Caveolin-1蛋白印记结果 Fig 2 Change of Caveolin-1 in brain tissue of rats 24 h, 48 hand 72 hafter ischemia reperfusion
与Sham组比较,aP < 0.05;与Model组比较,bP < 0.05 图 3 缺血-再灌注后24、48、72 h各组大鼠脑皮层中Caveolin-1蛋白表达变化 Fig 3 Change of Caveolin-1 in brain cortex of rats 24 h, 48 hand 72 hafter ischemia reperfusion
3 讨论

血脑屏障(BBB) 是主要由脑毛细血管内皮细胞、细胞间紧密连接(tight junction,TJ)、连续的基底膜和基底外侧的星型胶质细胞终足等结构构成,并保持中枢神经系统内环境的相对稳定[8]。脑缺血-再灌注可导致血脑屏障破坏,通透性增加,炎性因子及有害物质进入脑组织,引起脑水肿形成,从而加重脑损伤。脑缺血发生的时候,伊文氏蓝出现在缺血区,表明BBB通透性增加;脑组织相对含水量可用于估计大鼠脑水肿的程度。张红波等[9]通过腹腔注射醒脑静小剂量组(3.33 mL/kg)、中剂量组(6.66 mL/kg)、大剂量组(10 mL/kg)初步观察发现,醒脑静注射液对脑组织的保护作用存在较明显的量效关系。本实验采用腹腔注射醒脑静注射液10 mL/(k g·d),结果显示,大鼠全脑缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组的脑组织含水量均显著高于Sham组(P < 0.05),但在缺血-再灌注后48 h和72 h,Model组的脑组织含水量显著高于XNJ组和Sham组(P < 0.05)。缺血-再灌注后24 h,Model组和XNJ组大鼠脑组织内伊文氏蓝(EB)含量均高于Sham组(P < 0.05),缺血-再灌注后48 h和72 h,Sham组和XNJ组的EB含量显著低于Model组(P < 0.05)。提示全脑缺血-再灌注后出现脑水肿和血脑屏障的通透性增加,醒脑静有稳定血脑屏障通透性、减轻脑水肿的作用。

物质通过BBB的途径一般有细胞旁路和跨细胞途径两种。血管内皮细胞结构主要由质膜微囊和紧密连接构成,是BBB的基础,是阻止血浆蛋白进入大脑的主要成分,对BBB通透性的改变起着主要作用。Caveolae 的主要功能是介导跨细胞的内吞转运,另外还可能具有信号转导、细胞生长与凋亡及其他功能[4]。Caveolin-1(CAV-1)是一个整合膜蛋白(相对分子质量为21 000~24 000),是Caveolae的主要结构成分,是脑损伤后大分子物质通过跨膜传导作用进入内皮间隙,导致BBB功能紊乱的关键环节[10]。实验研究证实,许多大分子物质的跨细胞转运是通过CAV-1介导的胞吞途径来实现的,如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、低密度脂蛋白等[11]。Shen等[12]研究发现脑缺血-再灌注损伤引起CAV-1表达减少,下调CAV-1的表达引起血脑屏障的破坏,脑缺血所产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)能下调CAV-1的表达,而CAV-1的下调,能引起一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的增加,促进生成更多的NO。Gu等[13]则进行了系列研究,关注了脑缺血缺氧期CAV-1与金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)之间的相关性,提示缺血-再灌注损伤能下调离体培养的皮质微血管区、海马和皮质CAV-1的表达,认为脑缺血-再灌注损伤时活性氮、CAV-1、MMPs间的相互作用是BBB紊乱和梗死面积增加的主要原因;CAV-1能够调节NOS和MMP的活性以及BBB通透,活性氮与CAV-1互相作用,形成了一个反馈回路,通过激活MMPs而造成血脑屏障的不断破坏。脑脊液中和血液检测单一蛋白质有一定局限性,但结合现有技术,分析标志物变化,对判断脑损伤程度,评估预后,调整治疗方案有重要意义[14]。实验通过Western blot检测CAV-1蛋白的表达显示,缺血-再灌注后24、48、72 h,Model组和XNJ组大脑皮层中的CAV-1蛋白表达水平显著低于Sham组,随再灌注时间的延长,XNJ组的CAV-1蛋白表达水平逐渐增加,与Model组相比,XNJ组CAV-1蛋白表达水平增加显著(P < 0.05)。提示全脑缺血再灌后CAV-1蛋白表达水平下调,醒脑静能使表达下调的CAV-1蛋白显著升高,起到了保护BBB的作用,这可能是醒脑静注射液发挥对脑缺血-再灌注后BBB保护作用的机制之一。

醒脑静注射液是临床常用的中成药急救药品,该药具有醒脑开窍、清热凉血、行气活血和解热止痛等功效,静脉给药后可通过血脑屏障直接作用于中枢神经系统,具有兴奋中枢、解热、镇痛、抑菌、抗炎、保肝的药效[15]。本实验表明,醒脑静能调节CAV-1蛋白的表达,稳定血脑屏障通透性及减轻脑水肿。

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