创伤失血性休克(trauma-hemorrhagic shock T/HS)是常见的临床危重症，一直威胁着人类生命安全。T/HS继发的脓毒症(sepsis)及多脏器功能衰竭(multiple organ failure,MOF)已被认为是其导致死亡的最主要的原因，而肠道的屏障功能障碍目前已被广泛认为是导致脓毒症和MOF的重要机制。另一方面，肠道是创伤失血性休克发生后最容易遭受损伤的器官，早期炎症损伤导致的难以纠正的微循环障碍(毛细血管渗漏综合征)是肠道屏障功能损伤的重要原因^[1]。近年来的研究表明血管内皮糖萼的完整性对微循环功能具有重要的意义。糖萼是衬于血管内皮细胞管腔膜侧的一层绒毛状细胞结构，由内皮细胞合成并分泌的众多分子组成，其中蛋白聚糖作为糖萼的主要骨架蛋白可维持其与内皮细胞的联系。 糖萼作为心血管系统的重要屏障，具有维持血管通透性^[2]、抑制细胞间黏附^[3]等作用。Marechal等^[4]在研究中观察了大鼠小肠肌层毛细血管内皮细胞糖萼因对不同相对分子质量的右旋糖酐具有不同的透过性而发挥分子筛的作用，进而影响血管的通透性。更为深入的研究发现内皮所接触的血浆成分中TNF-α浓度过高可能是导致糖萼层降解的直接因素^[5]，而Chappell等^[6]则发现氢化可的松对缺血-再灌注损伤后血管内皮糖萼层具有保护作用，这一发现为糖皮质激素维护微循环稳定的诸多机制又增加了一种重要的可能。

本研究将以糖萼作为突破点，分析其结构损伤在T/HS早期肠道微循环障碍发生中的意义以及以氢化可的松为代表的糖皮质激素是否具有保护糖萼进而维护微循环稳定的作用，同时本研究将关注肠系膜上静脉(superior mesenteric vein,SMV) 血TNF-α的质量浓度及其合成的因素，进一步探讨氢化可的松对T/HS后肠道血管内皮糖萼及微循环功能保护的分子学机制。

8~10周龄雄性SD大鼠，体质量200~250 g。购自浙江大学医学院动物研究中心。

通过腹腔内注射1% 戊巴比妥 (0.4 mL/100 g)实施麻醉。分别对右侧颈静脉、颈动脉及左侧股动脉置管以备输液和测压及放血。钝性离断左侧股骨后经左股动脉快速放血(距模型开始20 min)直到MAP降至(30±5)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，维持90 min。对T/HS大鼠以2倍失血量的林格液(Ringer’ s，RS)进行匀速复苏(10 min)。最后拔除血管置管，缝合切口。

对120只SD大鼠进行随机(随机数字法)分组：①假手术组(SHAM，n=30)，仅行麻醉及血管置管，不予创伤、放血及液体复苏；②假手术治疗组(SHAM+H，n=30)，假手术大鼠给予氢化可的松(H5885,sigma)治疗，以30 g/kg的剂量溶于复苏液体中匀速进入大鼠颈静脉；③创伤休克组(T/HS，n=30)，进行完整的断股骨创伤、快速放血及液体复苏处理；④创伤休克治疗组(T/HS+H，n=30)，创伤休克大鼠在液体复苏时给予氢化可的松治疗。每组大鼠根据不同的检测及取材距离实验开始时间40、60、120、180、360 min分为5个小组(n=6)。分别留取每组大鼠外周血及肠系膜静脉血进行硫酸乙酰肝素,多配体聚糖-1及TNF-α检测；各时间点行平均动脉压 (mean arterial pressure,MAP) 及肠道肌层血流(blood flow in the intestine lamina muscularis，BFI) 监测；留取液体复苏后360 min小组大鼠小肠 进行电镜下糖萼直接观察及NF-κB免疫组化检测。

研究大鼠T/HS模型是否诱发了循环及小肠微循环动力学的改变，采用鼠尾袖带测压系统(tail-cuff system，BP-98A; Softron,Tokyo,Japan)^{[7, 8]}监测平均动脉压；并采用激光多普勒仪(Moor Instruments,Axminister,England)在各时间点组大鼠取材前麻醉状态下剖腹后监测肠道肌层微循环血流。

多配体聚糖-1及硫酸乙酰肝素作为糖萼的主要骨架蛋白可维持其与内皮细胞的联系。每组大鼠的外周血及肠系膜上静脉血均被收集，并采用ELISA分别进行多配体聚糖-1(Human CD138 / SYNDECAN-1 ELISA Kit，diaclone)、硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate ELISA Kit，日本生化工业株式会社)的检测，具体方法参照各ELISA试剂盒说明书。

采用免疫组化的方法检测小肠微循环内皮细胞phospho-p65 NF-κB的表达。选取10 μm厚的小肠石蜡切片脱蜡至水，0.3 g/L H₂O₂甲醇溶剂室温作用30 min，滴加山羊封闭血清1 h后分别滴加鼠抗p-p65 NF-κB抗体(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)一抗37 ℃1 h，加生物素化山羊抗兔IgG二抗37 ℃20 min，DAKO法染色，DAB显色，苏木精-伊红复染，脱水，透明封片后光镜下观察(Olympus IPP6.0; Tokyo,Japan)。高倍镜下(×40)，每张切片观察10个非重复视野，结合染色强度(0~3分分别代表染色强度由低到高)及阳性细胞比例(0~4分分别代表 0％~70％以上的阳性细胞比例)两项评分作为半定量评估方法^[11]，所有切片均由两名实验员进行双盲评分。

每组大鼠的外周血及肠系膜上静脉血均被收集，并采用ELISA法检测TNF-α (Quantikine ELISA Kit,R&D Systems,Minneapolis,USA)的变化，具体方法参照ELISA试剂盒说明书。

计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组间采用ANOVA 及 Tukey’ s test的检验方法通过SPSS 16.0软件进行分析。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

创伤失血性休克以及液体复苏不仅影响了体循环的血流动力学，同时更加持久地抑制了肠道肌层微循环的灌注。本研究中大鼠经诱导T/HS成功后MAP出现了明显的下降，但是经液体复苏MAP能够恢复正常，且氢化可的松未见明显干预效果(图 1A)。采用激光多普勒仪发现创伤休克发生后20 min BFI即已出现明显下降，且并未因液体复苏而恢复，液体复苏完成后60 min降至最低后逐渐回升，观察至创伤休克后360 min小肠BFI亦未能恢复至正常。氢化可的松的干预随着液体复苏的结束而结束，治疗结束后60 min，BFI已有明显恢复(P<0.05)，而创伤休克后360 min组BFI已基本恢复正常水平(图 1B)。

A:T/HS大鼠MAP的动态变化 模型开始20 min快速放血后MAP快速下降；110 min后开始进行液体复苏(维持10 min)后T/HS大鼠MAP可逐渐恢复正常，氢化可的松未现明显疗效。B：T/HS大鼠BFI动态变化 液体复苏后60 min(180 min)小肠BFI降至最低，360 min亦未能恢复正常；氢化可的松具有明显疗效。T/HS组与T/HS+H组比较，aP<0.05 图 1创伤休克大鼠MAP及BFI监测 Fig 1 Monitoring of MAP and intestinal perfusion in T/HS rats

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电镜能够直接观察到内皮层糖萼的结构及完整性。本研究发现SHAM组及SHAM+H组大鼠小肠微循环内皮细胞内侧的糖萼的结构是致密和完整的(图 2A、B)；而T/HS早期(3 h)即已出现内皮糖萼厚度变薄及结构松散(图 2C)，氢化可的松的干预可以明显减少糖萼的破坏(图 2D)，同时糖萼层的厚度检测已证实这一点(图 2E)。动态定量观察发现与外周血比较，T/HS大鼠SMV血中硫酸乙酰肝素及多配体聚糖-1质量浓度出现快速升高(40 min)及快速下降(3 h)的趋势，提示T/HS超早期即出现小肠血管内皮糖萼成分的丢失，氢化可的松的使用降低了SMV中糖萼分解成分的浓度波峰(图 3)。

A-D：电镜观察各组大鼠小肠微循环内皮糖萼层(箭头所指即为糖萼)；E：各组大鼠小肠微循环糖萼层的厚度对照 图 2 创伤休克大鼠的小肠毛细血管内皮糖萼损伤的电镜表现 Fig 2 Damages to glycocalyx inside the capillary endothelium in the intestine shown by electron microscopy

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A：各组大鼠肠系膜上静脉硫酸乙酰肝素质量浓度变化趋势；B：各组大鼠外周血硫酸乙酰肝素质量浓度变化趋势；C：各组大鼠肠系膜上静脉多配体聚糖-1质量浓度变化趋势；D 各组大鼠外周血多配体聚糖-1质量浓度变化趋势。T/HS组与T/HS+H组比较，aP<0.05 图 3 创伤休克大鼠SMV及外周血中糖萼成分的动态改变 Fig 3 Serum levels of glycocalyx components in the SMV and peripheral blood

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TNF-α在小肠微循环及内皮细胞的局部微环境中的含量增加可能参与了糖萼的结构破坏的发生机制。发现T/HS发生后20 min大鼠SMV血中TNF-α质量浓度即出现明显的升高(图 4A)，且其较高质量浓度维持的时间较长(约3 h)，而外周血TNF-α质量浓度的峰值明显低于SMV血(图 4B)。相对于SHAM组及SHAM+H组(图 5A、B)大鼠，T/HS发生后360 min后小肠血管内皮出现NF-κB的高表达(图 5C)，它可能是小肠TNF-α大量分泌进而诱导内皮糖萼降解的可能机制之一。氢化可的松能够降低SMV中TNF-α的质量浓度(图 4A)，同时明显降低NF-κB的表达(图 5D、E)，其可能为糖皮质激素对T/HS大鼠小肠内皮糖萼具有保护作用的潜在机制。

A：各组大鼠肠系膜上静脉TNF-α质量浓度变化趋势；B：各组大鼠外周血TNF-α质量浓度变化趋势；T/HS组与T/HS+H组比较，aP<0.05 图 4 T/HS大鼠SMV及外周血中TNF-α质量浓度的动态改变 Fig 4 Serum levels of TNF-α in the SMV and peripheral blood

图选项

A-D：电镜观察各组大鼠小肠毛细血管内皮NF-κB的表达(黄色箭头所指)；E：各组大鼠小肠毛细血管内皮NF-κB的表达强度对照 图 5 T/HS大鼠的小肠毛细血管内皮NF-κB的表达 Fig 5 The expression of NF-κB in the vascular endothelium

图选项

严重创伤性休克可引发小肠严重的微循环障碍及灌注下降，微循环障碍表现为内皮细胞肿胀，血管通透性增加^[12]和白细胞黏附、迁移^[13]。中性粒细胞/内皮细胞黏附可产生足够的O^2-和细胞毒性酶(弹力蛋白酶和胶原酶等)，继续损害或摧毁实质和内皮细胞，并形成恶性循环，最终导致组织不可逆的病理改变。而小肠的灌注剧烈下降往往与心排血量下降不成比例，同时恢复灌注又远迟于全身^[14]。本研究发现，T/HS诱导了大鼠小肠出现显著的不能用平均动脉压变化来解释的灌注下降。

糖萼是衬于血管内皮细胞管腔膜侧的一层绒毛状细胞结构，由内皮细胞合成并分泌的众多分子组成，其中蛋白聚糖作为糖萼的主要骨架蛋白可维持其与内皮细胞的联系，其成分包括：硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质烷及硫酸角质素，降解其中的一些成分可导致糖萼降解^[15]。Chappell等^[6]等发现在冠脉缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,I/R)等疾病过程中或外源性物质(透明质酸酶等)刺激下，糖萼的结构受到破坏，毛细血管壁的通透性增加，间质水肿；同时血管内皮细胞暴露，诱导白细胞与其黏附，进一步加重炎症爆发及血管内皮的损伤。Marechal等^[4]在研究中观察了大鼠小肠肌层毛细血管内皮细胞糖萼对荧光标记的不同相对分子质量的右旋糖酐的通透情况，发现较大的分子(150 000)不能透过糖萼，而较小的分子(4 000)容易透过糖萼，提示糖萼可以发挥分子筛的作用，影响血管的通透性。而小肠在发生缺血-再灌注过程后较大分子右旋糖苷亦能通过糖萼。

本研究通过电镜及SMV血中糖萼成分等检测发现T/HS发生早期小肠黏膜下毛细血管内皮糖萼的结构即出现了明显的破坏，同时笔者发现SMV血中的糖萼的主要成分——硫酸乙酰肝素和多配体聚糖-1的质量浓度明显升高，从而进一步证实了上述表现。

新近的研究发现内皮糖萼的破坏可能与机体在遭受感染性休克等应急状态下分泌过多肿瘤坏死因子α(TNF-α)有关。Henry和Duling^[5]利用岩藻依聚糖阻断中性粒细胞与内皮细胞的黏附后TNF-α仍旧能够诱导糖萼的损伤，初步证实TNF-α可能通过中性粒细胞非依赖方式直接作用于内皮细胞，后者释放氧自由基、蛋白激酶、磷脂酶造成糖萼损伤。Chappell等^[16]的研究发现使用抗凝血酶能够通过改善内皮细胞的炎症反应、缓解TNF-α所诱导的糖萼破坏，进一步证实了血管内皮细胞本身的炎症状态，尤其是在TNF-α作用下所形成的局部炎症反应体系是决定糖萼结构完整性的重要因素。创伤失血性休克又是如何诱导内皮细胞产生TNF-α的？ 细胞表面Toll样受体4 (toll-like receptor 4，TLR4)和跨膜蛋白髓样分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)及其下游的p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)、核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB) 作为一种经典的信号传导通路在创伤和休克发生后的迅速激活对TNF-α合成表达起到了重要的调控作用。本研究发现T/HS大鼠小肠毛细血管内皮细胞浆内NF-κB表达明显增高；另一方面T/HS大鼠SMV血中TNF-α的质量浓度较外周血更高、维持的时间更长，说明创伤休克后肠道来源(汇入SMV)的TNF-α可能是其全身总量升高的主要贡献者之一，同时小肠内皮细胞NF-κB的高表达可能成为其TNF-α合成增加以及糖萼破坏的主要机制。由此笔者进一步推测肠道作为T/HS病理生理状态中最易受损的器官，不仅出现了严重的微循环等衰竭，同时亦可能成为全身炎症爆发的主要贡献者，这还需要进一步的研究来证实。

氢化可的松长期以来被临床用于防治继发于缺血-再灌注损伤后毛细血管渗漏综合征及组织水肿，其可能的机制与其抑制由多种炎症介质及细胞因子介导的炎症细胞浸润的作用有关^[17]；此外氢化可的松亦具有稳定细胞膜及细胞器膜尤其是溶酶体膜的作用，能减少溶酶体酶的释放及降低血管活性物质、组胺、缓激肽、儿茶酚胺的质量浓度^{[18, 19]}、抑制白细胞产生氧自由基^[20]，而溶酶体酶、血管活性物质、氧自由基的释放增多均与肠缺血及再灌注损伤的病理相关，造成组织损伤及血管通透性增加。 Chappell等^[6]的研究开创性地发现了氢化可的松能够有效地保护内皮糖萼结构的稳定性并有效改善缺血-再灌注损伤后组织水肿的程度。本研究在更为接近于真实情况的创伤休克模型上证实氢化可的松能够较为明显地减少小肠微循环内皮细胞NF-κB的表达及SMV血中TNF-α的质量浓度，减少糖萼的分解及损伤并恢复肠道微循环的血流。这与有关糖皮质激素具有通过抑制NF-kB的活性来阻遏TNF-α的表达的作用^{[21, 22]}的研究结果是相辅相成的。由此笔者初步判断氢化可的松能够较为有效地保护小肠内皮糖萼的完整性及微循环的功能进而改善全身的炎症状态，其作用机制可能与抑制TNF-α的合成及其相关的信号通路有关。但是糖皮质激素是否能在创伤休克发生后具有保护肠道屏障功能，是否抑制细菌移位及脓毒血症的发生，尚需进一步的研究证实。

综上所述，糖萼的破坏可能参与了创伤失血性休克后小肠微循环障碍及屏障功能损伤的机制，内皮细胞NF-κB表达活化及TNF-α的大量合成可能参与了糖萼破坏的分子学机制。以内皮细胞糖萼作为治疗靶点，氢化可的松可能具有较好的疗效。