中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (4): 408-412
应用动物体温维持仪与仿真热气候动物舱建立大鼠经典型热射病模型的比较
李慧敏, 陈晓娟, 陈芳, 付炜, 唐忠志     
510515 广州,南方医科大学附属武汉临床学院(李慧敏、陈芳、唐忠志);
510515 广州,广州军区武汉总医院急诊科(陈晓娟、付炜、唐忠志)
摘要目的 比较应用动物体温维持仪与仿真热气候动物舱建立的大鼠经典型热射病(CHS)模型的异同。 方法 雄性SPF级Wistar大鼠24只,随机(随机数字法)分为室温对照(C-C)组、高温对照(HS-C)组、高温麻醉(HS-A)组。HS-C和HS-A 组大鼠分别使用仿真热气候动物舱和动物体温维持仪行35 ℃热暴露,监测各组大鼠动脉收缩压(SBP)、核心体温(Tc)变化,记录发病时间,比较两组大鼠白细胞(WBC)计数、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)等炎症指标变化及大脑、肺、肝、小肠、肾等主要器官病理改变。 结果 HS-A组大鼠发病时间比HS-C组明显缩短[(40.0 ± 4.3) min vs.(110.1 ± 5.3)min,P<0.01],发病时SBP及Tc比HS-C组低(159.1 ± 5.91) mmHg vs.(174.54 ± 5.77) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),P< 0.01;(43.5 ± 0.4) ℃vs.(44.4 ± 0.2) ℃,P< 0.01)。建模后两组大鼠WBC、CRP、TNF-α、IL-1β水平较C-C组均显著升高(P<0.01),且HS-A组炎性因子水平比HS-C组低(P<0.01),但WBC计数差异无统计学意义(P>0.05);两组大鼠大脑、肺、肝、小肠、肾等主要器官病理无明显改变。 结论 应用动物体温维持仪建立大鼠CHS模型与仿真热气候动物舱法差异无统计学意义,并且能够明显缩短建模时间、节约成本,是一种简易、可靠而又经济的模型建立方法,可以替代仿真热气候动物舱法。
关键词热射病     动物模型     大鼠动物     体温维持仪     仿真热气候动物舱    
Comparison between animal temperature controller and artificial climate chamber employed for the establishment of classical heat
Li Huimin, Chen Xiaojuan, Chen Fang, Fu Wei, Tang Zhongzhi     
Wuhan Clinical Institute Affiliated to Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Corresponding author: Tang Zhongzhi, Email:zhzhtang@163.com
Abstract:Objective To investigate the differences between animal temperature controller (ATC) and artificial climate chamber (ACC) used for the establishment of classical heat stroke (CHS) rat model. Methods Twenty-four male specific pathogen-free Wistar rats were randomly(random number) and equally assigned to three groups, namely room temperature control (C-C) group,heat stroke under conscious state (HS-C) group, and heat stroke under anesthesia (HS-A) group. Rats of HS-C or HS-A group were placed into ACC or ATC, then exposed to 35 ℃ heat stress. The systolic blood pressure (SBP) and core body temperature (Tc) were monitored. The time required for onset of HS was recorded. The white blood cell count (WBC) in peripheral blood and serum levels of C-reactive protein (CRP), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-1 beta (IL-1β) were measured. The histopathological changes of major organs were also confirmed by hematoxylin-eosin (HE) staining. Results The onset time in HS-A group was significantly shorter than that in HS-C group [(40.0 ± 4.3)min vs.(110.1 ± 5.3)min,P < 0.01]. The SBP and Tc at this moment were lower in HS-A group [(159.1 ± 5.91) mmHg vs.(174.54 ± 5.77)mmHg,P < 0.01;(43.5 ± 0.4)℃ vs.(44.4 ± 0.2)℃,P < 0.01]. The WBC, CRP, TNF-α and IL-1β levels of these two HS groups were dramatically elevated compared with C-C group (P < 0.01). The inflammatory cytokines levels in HS-A group were significantly lower than those in HS-C group (P < 0.01), but there was no difference in WBC between them (P > 0.05). However, there was no obvious difference in histopathological change in major organ observed between HS-A and HS-C groups. Conclusions In comparison of these two methods, ATC is similar to ACC in respect of the establishment of CHS rat model. ATC is quicker in onset of HS, and more simplified and economical than ACC and could substitute ACC.
Key words: Heat stroke     Experiment animal model     Rat     Animal temperature controller     Artificial climate chamber    

热射病(heat stroke,HS) 是一种急性热致疾患,典型临床表现为高热(>40 ℃) 、无汗和意识障碍[1],病死率高达10%~50%[2, 3, 4],即便幸存者也有约30%遗留永久性神经系统及肢体功能障碍[5]。按发病原因不同分为经典型热射病(classical heat stroke,CHS)和劳力型热射病(exertional heat stroke,EHS)[1]。随着全球气候变暖和城市热岛效应加剧,夏季极端气候不断出现,HS的发生率和病死率明显上升[6, 7, 8, 9],已经成为严重威胁公共健康的疾病之一。目前HS的发病机制尚不清楚,而HS动物模型的建立对阐明其机制具有重要意义。传统的CHS动物模型建立方法是将大鼠置于仿真热气候动物舱内、模拟高温高湿环境促使其发病。然而仿真热气候动物舱设备价格昂贵、体积庞大,因而限制了其应用。而动物体温维持仪建模时间短、成本低、实验条件要求相对降低,具有广泛应用的潜在价值,但目前尚无两种方法对比的研究。因此,本研究旨在比较两种建模方法的异同,评估动物体温维持仪建模方法的应用价值。

1 材料与方法 1.1 主要仪器设备及试剂

仿真热气候动物舱(南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供),PowerLab数据采集分析系统(澳大利亚ADInstruments公司),SS-20-2型动物体温维持仪(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司),LH750全自动血液分析仪(美国BECKMAN COULTER公司),ELISA 试剂盒[C-反应蛋白(CRP):德国Immudiagnostik公司;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β):美国 R&D 公司]。

1.2 实验动物及分组

8~10周龄SPF级雄性Wistar大鼠24只(购于南方医科大学实验动物中心),体质量220~250 g,于南方医院实验动物中心适应性饲养1周,环境温度(25±1)℃,相对湿度(60±5)%,自由摄食、进水。所有大鼠在实验前1周接受PowerLab数据采集分析系统的无创血压测量训练,频率为3次/d。实验大鼠随机(随机数字法)分为3组,每组8只,分别为室温对照(C-C)组、高温对照(HS-C)组、高温麻醉(HS-A)组。

1.3 实验方法

HS-A组大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉,麻醉深度以疼痛反射消失,呼吸、心率平稳为标准,稳定5 min后进行后续实验。实验期间所有大鼠禁食、禁水,室温维持在(25±1)℃。C-C组置于室温自由活动; HS-C组置于预设干球温度(35±0.5)℃、湿球温度(27±0.5)℃的仿真热气候动物舱内进行热暴露;HS-A组麻醉后置于预设温度为35 ℃的动物体温维持仪的电热毯内,并保证大鼠躯体所有部分均未外露,根据大鼠意识状态适时酌量增加水合氯醛注射。

1.4 监测指标

大鼠分别于实验开始前(0 min)、实验开始后每隔5 min连接PowerLab数据采集分析系统监测大鼠核心体温(Tc,以直肠温度代替)、动脉收缩压(SBP,以尾动脉收缩压代替),直至SBP上升至峰值后开始下降作为大鼠HS发生的标志,记录大鼠发病时间及Tc。大鼠发生HS后,立刻将其转移至室温环境。所有大鼠于建模前1 d、建模结束时麻醉后经内眦静脉采取1.5 mL血液(代表外周血),其中0.5 mL使用全自动血液分析仪进行白细胞(WBC)计数,其余1 mL离心后取上清液,ELISA检测血清CRP、TNF-α、IL-1β浓度;建模结束时麻醉后开颅、开腹,观察各组大鼠大脑、肺、肝、小肠、肾等主要器官大体病变,并留取相应标本行苏木精-伊红(HE)染色,观察组织病变。

1.5 统计学方法

实验数据使用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料用均数± 标准差(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多样本均数间的多重比较采用LSD-t检验;计数资料以频数和率表示,组间比较采用χ2检验。以P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 发病时间、SBP及Tc变化

HS-A组大鼠发病时间比HS-C组明显缩短[(40.0 ± 4.3) min vs.(110.1 ± 5.3) min,t=-25.686,P<0.01],发病时SBP及Tc比HS-C组低[(159.1 ± 5.91) mmHg vs.(174.54 ± 5.77) mmHg,t=5.519,P< 0.01;(43.5 ± 0.4) ℃vs.(44.4 ± 0.2) ℃,t=-5.872,P< 0.01](图 1)。

图 1 三组大鼠SBP及Tc随时间变化情况 Fig 1 Systolic arterial blood pressure and core temperature on the time course
2.2 建模前后三组大鼠炎症相关指标比较

HS-A组与HS-C组大鼠建模后外周血WBC计数、CRP、TNF-α、IL-1β等炎症相关指标升高,与建模前相比差异具有统计学意义(P< 0.01)。建模后HS-A组大鼠CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子水平比HS-C组低[(14.88 ± 2.56) μg/mL vs.(20.86 ± 2.99)μg/mL,P< 0.01;(75.38 ± 1.84) pg/mL vs.(83.38 ± 3.52)pg/mL,P< 0.01;(160.07 ± 4.85) pg/mL vs.(173.42 ± 3.82)pg/mL,P< 0.01],而两组大鼠WBC计数差异无统计学意义[(13.73 ± 2.20)×109 L-1 vs. (13.92 ± 1.64) ×109 L-1P=0.849]见图 2

HS-C和HS-A组比C-C组,aP< 0.01;HS-A组比HS-C组,bP< 0.01。 图 2 建模前后三组大鼠炎症相关指标变化 Fig 2 Levels of WBC, CRP, TNF-α and IL-1β in serum before/after heat exposure
2.3 两组模型大鼠主要脏器病理改变

(1)大体改变:与C-C组大鼠相比,HS-A和HS-C组大鼠脑体积增加,脑回变宽、扁平,脑沟变浅、窄,白质水肿明显;双肺肿胀,呈暗红色,可见散在出血点及大片出血斑;肝脏肿大,包膜紧张,表面光滑,色暗红;小肠缺血、肿胀,色苍白,蠕动减弱;肾脏体积略增大,被膜稍紧张,色暗红,纵切面可见皮质缺血明显。(2)镜下:与C-C组大鼠相比,HS-A和HS-C组大鼠脑组织疏松,细胞和血管周围间隙变大,神经元、神经胶质细胞肿胀、胞质淡染,部分神经元出现核固缩、胞体缩小变形、尼氏小体消失、胞质深红染,即红色神经元;局部可见噬神经现象(图 3)。肺间质毛细血管扩张、充血、大量炎性细胞浸润,可见散在点状出血;微血管内可见混合血栓形成和白细胞栓塞;在肺呼吸性细支气管、肺泡管的内表面可见透明膜形成;肺泡明显扩张,上皮细胞肿胀、脱落,肺泡间隔明显增厚并断裂,相邻肺泡融合(图 4)。肝小叶结构紊乱,肝细胞大片水肿,胞质疏松、淡染,呈半透明状,以肝小叶中央静脉周围为重;部分肝细胞可见核固缩、碎裂、溶解;门管区可见大量炎性细胞浸润;微血管内可见红细胞瘀滞、混合血栓形成(图 5)。小肠壁水肿、增厚,绒毛结构紊乱、破坏,上皮细胞可见变性、坏死、脱落,局部大量炎性细胞浸润(图 6)。肾小球无明显改变,肾小管上皮肿胀,部分细胞坏死、脱落,管腔内可见管型形成,间质水肿、散在出血,炎性细胞浸润不明显(图 7)。

A:C-C组;B:HS-C组;C:HS-A组;B、C示脑组织疏松,神经元和胶质细胞肿胀、胞质淡染;黑色箭头示噬神经现象,黄色箭头示红色神经元 图 3 大鼠大脑HE染色镜下观察(×200) Fig 3 HE staining shown lesions of brain in groups C-C (A), HS-C (B), and HS-A (C) under microscope (×200)
A:C-C组,B:HS-C组,C:HS-A组;B、C示肺间质血管扩张、充血,散在点状出血,大量炎性细胞浸润;肺泡明显扩张,间隔增厚、断裂,上皮细胞肿胀、脱落;黑色箭头示透明膜形成,黄色箭头示微血管内混合血栓形成,红色箭头示脱落的上皮细胞 图 4 大鼠肺HE染色镜下观察(×200) Fig 4 HE staining shown lesions of lung in groups/C-C (A), HS-C (B), and HS-A (C) under microscope (×200)
A:C-C组,B:HS-C组,C:HS-A组;B、C示肝小叶结构紊乱,肝细胞大片水肿,门管区大量炎性细胞浸润;黑色箭头示肝细胞坏死后炎性细胞浸润,黄色箭头示红细胞瘀滞、混合血栓形成 图 5 大鼠肝脏HE染色镜下观察(×200) Fig 5 HE staining shown lesions of liver in groups/C-C (A), HS-C (B), and HS-A (C) under microscope (×200)
A:C-C组,B:HS-C组,C:HS-A组;B、C示小肠绒毛结构紊乱,部分上皮细胞变性、坏死、脱落,局部可见炎性细胞浸润;黑色箭头示脱落的上皮细胞,黄色箭头示局部炎性细胞浸润 图 6 大鼠小肠HE染色镜下观察(×200) Fig 6 HE staining shown lesions of small intestine in groups/C-C (A), HS-C (B), and HS-A (C) under microscope (×200)
A:C-C组,B:HS-C组,C:HS-A组;B、C示肾小管上皮细胞肿胀,管腔变窄,间质可见散在出血、炎性细胞浸润;黑色箭头示管型形成;黄色箭头示肾小管上皮细胞坏死、脱落 图 7 大鼠肾脏HE染色镜下观察(×400) Fig 7 HE staining shown lesions of kidney in groups/C-C (A), HS-C (B), and HS-A (C) under microscope (×400)
2.4 HS-A组与HS-C组模型病死率比较

HS-A组大鼠在热暴露过程中死亡1只,HS-C组在热暴露过程中死亡1只、热暴露结束时死亡1只。两组病死率差异具有统计学意义(χ2=6.250,P=0.012)。

3 讨论

本研究应用动物体温维持仪所建立的大鼠模型(HS-A组)大体及镜下病理改变与使用仿真热气候动物舱所建立模型(HS-C组)并无明显差异,而HS-A组大鼠的炎症因子水平较低、病死率S-A组大鼠发病时SBP及Tc比HS-C组大鼠低。

两种方法所建立模型炎症反应及病理改变均符合HS的病理生理改变[5]。HS-A组大鼠病死率较低,可能与炎性因子水平较低有关。因其处于麻醉状态,机体应激能力明显下降、发生免疫抑制,加之麻醉本身的抗炎作用[10],导致炎症反应减弱;还可能因实验样本量较小而导致统计学差异。该组大鼠发病时SBP及Tc比HS-C组大鼠低可能与其处于麻醉状态导致血管张力降低、血压及体温调节能力下降[11, 12, 13]有关。HS-A组炎性因子水平较HS-C组低,但两组大鼠器官损伤并无明显差异,这与HS早期以直接热损伤为主[5]有关。

目前建立大鼠CHS模型的方法主要有仿真热气候动物舱法[14, 15]和电热毯包裹法[4, 16]等。本研究方法即属于电热毯包裹法。从整体环境的模拟来看,仿真热气候动物舱具有温度、湿度、光照可控的特点,能够模拟自然环境;且建模过程中大鼠处于清醒状态,更接近自然发病过程,但其建立模型所需成本及条件要求很高,国内许多实验室都未能达到,因此限制了其应用。而电热毯包裹法建立模型时大鼠需处于麻醉状态,同时缺乏湿度及光照的调节,即大鼠整个发病过程处于一种非自然状态,这就不能观察大鼠发病过程中的症状变化。但因其建模时间短、成本低、实验条件要求相对降低,因而也被广泛采用。而且将大鼠麻醉之后再建立模型能够减轻动物所遭遇的痛苦,更符合动物伦理、更人道。目前关于这两种方法应用的比较尚未见报道。本研究通过对比两种建模方法,证实应用动物体温维持仪建立大鼠CHS模型与仿真热气候动物舱法无明显差异,并且能够明显缩短建模时间、节约成本,是一种简易、可靠而又经济的大鼠CHS模型建立方法,可以代替仿真热气候动物舱法。

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