美托洛尔(metoprolol，Meto)是目前临床常用的肾上腺素β1受体阻滞剂，有抗心律失常、抗心肌重塑等多重心脏保护作用。连接蛋白43(connexin43,Cx43)作为心脏中表达最丰富的连接蛋白(connexin,Cx)，与心脏疾病中心室异常收缩关系密切。Salameh等^[1]的研究发现Meto不同异构体能阻止心脏间隙连接(gap Junction，GJ)通道Cx43的降解而上调离体乳鼠心肌细胞GJ通道Cx43表达。笔者在离体乳鼠心肌细胞中的研究则发现Meto具有独特的维持Cx43去磷酸化状态的作用^[2]。为进一步探讨Meto的心脏保护机制与Cx43表达及磷酸化调控的关系，笔者用动物实验在体研究不同剂量Meto对HF大鼠Cx43表达及分布影响，以探讨其心脏保护作用的内在机制。

SPF级雄性SD大鼠 100只，体质量180～200 g,由中山大学实验动物中心提供(合格证号：0096235)。随机(随机数字法)分为5组：(1)假手术组(sham组，n=20)；(2) 心力衰竭模型组(HF组，n=20)；(3)美托洛尔治疗低剂量组(Meto A组，n=20)；(4)美托洛尔治疗中剂量组(MetoB组，n=20)；(5)美托洛尔治疗高剂量组(MetoC组，n=20)。行次全结扎腹主动脉法建立压力负荷型心力衰竭模型，sham组不结扎腹主动脉,其余操作同模型组。大鼠术后喂养8周，Meto治疗组术后第4周开始每日分两次灌胃给药(酒石酸美托洛尔片，阿斯利康制药有限公司) [剂量：MetoA组1.25 mg/(kg·d); MetoB组5 mg/(kg·d); MetoC组20 mg/(kg·d)]，sham组和HF组正常喂养。术后8周测定心功能后取心脏行下游实验。

大鼠术后8周检测心功能后立即开胸取出心脏和肺脏，冰生理盐水冲洗血液，剪除大血管和心外膜脂肪组织，滤纸吸干后称量全心湿质量(heart weight，HW)、 全肺湿质量(lung weight，LW)，计算心质量指数(全心重量/ 体质量，HW/ BW)、肺质量指数(肺质量／体质量比，LW／BW)。大鼠心脏称质量后置冰上去除心耳心房，平行于房室沟于左室长轴中点处将心室分为心尖部和心底部，心尖部Western blotting检测T-Cx43、P-Cx43蛋白表达；心底部4％多聚甲醛固定12 h后，石蜡包埋切片，免疫组化观察T-Cx43表达及分布模式。

大鼠心脏组织切片脱蜡，水化，胰酶消化，H₂O₂灭活内源性酶，10％正常羊血清室温封闭15 min后以1∶ 1000 Total-Connexin 43兔抗鼠多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司，Cat#：3512)湿盒4 ℃孵育过夜，阴性对照PBS取代一抗。 PBS漂洗后滴加1∶ 2000羊抗兔二抗(IgG-HRP，美国SIGMA公司)室温湿盒中孵育30 min。DAB显色5 min,流水终止发色反应，苏木素复染核后脱水、透明、封片。大鼠心肌细胞T-Cx43的阳性信号存在于细胞间端端连接处,光镜下呈棕黄色。采用美国Pixere Pro-150ES显微数码成像与分析系统进行免疫组化结果图像采样行半定量分析。测量各视野下阳性产物面积、平均灰度值以及背景空白区平均灰度值，计算各例阳性产物校正灰度值(背景空白区平均灰度值-阳性产物平均灰度值)，求出阳性指数(positive index,PI=阳性产物面积×阳性产物校正灰度值)后统计各组Cx43免疫组化染色阳性指数总均值(total mean positive index,TMPI)之间的差异性。

冰上提取大鼠心尖部左心室总蛋白后测定总蛋白质质量浓度，每孔加入50 μg总蛋白质进行SDS－PAGE(10％的分离胶)电泳，电转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h。一抗(1∶ 400 Total-Connexin 43兔抗鼠多克隆抗体，美国Cell Signaling Technology，Cat#：3512；1∶ 400 P-Cx43兔抗鼠多克隆抗体，美国Cell Signaling Technology公司，Cat#：3511)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗(1∶ 2000)室温下孵育2 h，以GAPDH(1∶ 2000)抗体作内参照。洗膜后ECL试剂显影。采用Epson 彩色图像扫描仪对胶片扫描，以NIH Image J软件计算目的蛋白与GAPDH的比值。

所得数据使用SPSS 16．0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Games-Howell法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

术后8周各组大鼠心重指数(HW/ BW)和肺重指数(LW/ BW)之间比较示差异具有统计学意义，且与Sham组比较，HF组大鼠心质量指数(4.01 ±0.13，P＜0.01)及肺质量指数(9.04 ±0.23，P＜0.01)增加明显。Meto治疗组各不同剂量组与HF组组间比较示治疗组心质量指数及肺质量指数均较HF组有所降低(P＜0.01)。Meto治疗组各不同剂量组间比较则见心质量指数随治疗剂量增加而逐渐降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；中剂量MetoB组肺质量指数亦较小剂量MetoA组降低(P=0.003 )，而大剂量MetoC组肺质量指数则较中剂量MetoB组有所上升，差异具有统计学意义(P=0.000)。见表 1。

图 2A 为Sham组左室心肌纵切图，棕黄色信号代表T-Cx43，主要分布于心肌细胞纵轴方向闰盘中，分布规则呈斑点状，侧对侧连接处T-Cx43表达量极少；与Sham组比较，HF组T-Cx43表达明显增加，并连接成链条状或带状，且分布模式亦发生改变，分布紊乱，侧对侧连接处的T-Cx43表达明显增加；Meto A组、Meto B 组及Meto C组的T-Cx43表达较Sham组显著增加，但随着剂量逐渐增加其分布紊乱情况较前逐步改善，侧对侧连接处T-Cx43表达逐渐减少或消失。阴性对照显示心肌细胞上无阳性物质显色。各组心肌细胞T-Cx43免疫组化染色阳性指数总均值分析比较可见HF组TMPI(163.73±15.04)较Sham组(32.75±9.22)显著增加(P＜0.01)，Meto C组(61.18±13.58)较HF组显著降低(P＜0.01);而Meto A组(161.99±15.50)、Meto B 组(159.27±17.79)与HF组组间比较差异无统计学意义(Meto A: P=0.514>0.05; Meto B：P=0.088>0.05)。Meto治疗组各组间比较示Meto A组与Meto B组差异亦无统计学意义(P=0.278 >0.05)，而大剂量组Meto C与Meto A组(P＜0.01)和Meto B组(P＜0.01)间比较则明显降低，差异具有统计学意义。

图 2 各组心肌组织T-Cx43免疫组化染色图(×200) Fig. 2 T-Cx43 immunohistochemical staining(×200) representative results of rats left ventricular total protein in various groups

图选项

Western blot结果代表图 3-1显示，在T-Cx43兔抗鼠多克隆抗体检测样本中可见在相对分子质量41 000及43 000处可见NP-Cx43、P-Cx43两条清晰的表达条带。HF组NP-Cx43、P-Cx43条带较sham组明显增粗，予Meto治疗后P-Cx43条带随治疗剂量的增加而变细变淡；而NP-Cx43条带则随治疗剂量的增加在中小剂量是变化不大，在大剂量时明显变细变淡。进一步半定量分析显示5组大鼠T-Cx43表达条带的光密度比值(T-Cx43/GAPDH)分别为sham组(0.26±0.12),HF组(1.31±0.08)，Meto A组(1.34±0.08)，Meto B 组(1.32±0.10)，Meto C组(0.57±0.14)。可见HF组中T-Cx43表达量较sham组显著升高(P＜0.01)，而予Meto治疗后各治疗组较HF组T-Cx43表达量在小剂量组及中剂量组无显著降低(Meto A vs. HF，P=0.124 >0.05；Meto B vs. HF，P=0.884 >0.05)，在大剂量组则显著下降 (Meto C vs. HF，P＜0.01),Meto治疗组各组间比较示Meto A组与Meto B组差异无统计学意义(P=0.565 >0.05)，而大剂量组Meto C与Meto A组(P＜0.01)和Meto B组(P＜0.01)间差异具有统计学意义。

Western blot结果代表图 3-2显示在P-Cx43兔抗鼠多克隆抗体检测样本中可见在相对分子质量43 000处可见P-Cx43清晰表达条带。HF组P-Cx43条带较sham组明显增粗，予Meto治疗后P-Cx43条带随治疗剂量的增加而变细变淡。进一步半定量分析显示5组大鼠P-Cx43表达条带的光密 度比值(P-Cx43/GAPDH)分别为sham组(0.59±0.10),HF组(1.28±0.12)，MetoA组(1.12±0.15)，MetoB组(0.90±0.11)，MetoC(0.77±0.13)。可见HF组中P-Cx43表达量较sham组显著升高(P＜0.01)，而予Meto治疗后各治疗组较HF组P-Cx43表达量均显著降低(MetoA vs. HF，P＜0.05；MetoB vs. HF，P＜0.01；MetoC vs. HF，P＜0.01),Meto治疗组各组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。

图 3 各组大鼠左心室总蛋白T-Cx43及P-Cx43 WB结果 Fig. 3 T-Cx43 and P-Cx43 WB representative results of rats left ventricular total protein in various groups

图选项

β受体阻滞剂作为负性肌力药物，早在20世纪70年代尝试应用于临床治疗HF之初就存在诸多争议^[3]。有研究显示在急诊采用小负荷量+维持量给药法即持续静脉给予Meto来控制快速性室上性心律失常的心窒率，可缩短患者急诊留观时间，降低医疗费用^[4]。但由于担心分次静脉或剂量的个体差异而出现严重低血压、心动过缓、加重心衰等不良反应，在心力衰竭急性期Meto急诊用药鲜有报道。

前期动物研究提示Meto治疗对HF大鼠血流动力学的改善有“天花板效应”，中剂量的Meto治疗在HF大鼠中可获得最大的血流动力学获益^[5]。这一有益效应优于无直接血流动力学改善作用而有改善心肌重塑作用的抗心衰药物如螺内酯^[6]。本实验大鼠心脏全心湿质量、全肺湿质量、体质量及心重指数、肺重指数结果亦提示模型大鼠在心肌肥厚基础上出现了HF，Meto治疗可以改善心肌重塑和肺淤血、肺水肿，但大剂量Meto治疗虽然在心脏重塑的改善中呈“剂量依赖效应”，但较中剂量可能限制心功能的进一步改善。实验结果进一步证实对已明确诊断的HF患者应早期应用Meto，但剂量的选择则更应该及时依据患者的HF症状及血流动力学的改善来调整，从而降低患者病死率和心血管事件的发生。

心肌Cx组装成六聚体后转运至细胞膜构成Cx半通道，相邻细胞Cx半通道结合构成细胞间Cx GJ通道。GJ通道介导心肌电耦联及化学信息交流(缝隙连接通道介导的细胞间通信)，而GJ通信在细胞生长周期调控和组织发育中起重要作用^{[7, 8]}。Cx43在心肌缺血时极易降解，Cx43的降解及分布模式改变是心肌缺血后心肌细胞在分子水平上发生的最初电生理重构,直接导致心肌细胞间电偶联失常，是多种心律失常发生的解剖学基础^{[9, 10, 11]}。心肌细胞间Cx失偶联后电冲动传导从时间上来说传导速度明显减慢,从空间上来说传导的各向异性发生改变，这些改变将导致传导阻滞和折返，诱发心律失常发生^{[10, 11, 12]}。陈葵等^[13]在家兔心肌梗死边缘区Cx43分布的影响发现，卡维地洛可以引起Cx43的再分布,增加心肌梗死后Cx43蛋白的表达,提示可能是其较减少心肌梗死后室性心律失常的原因之一。

本实验发现HF大鼠心脏T-Cx43表达明显增加，且分布紊乱，侧对侧连接处T-Cx43表达明显增加。中小剂量Meto治疗虽然未能明显减少HF大鼠心脏T-Cx43表达，但随着剂量逐渐增加其T-Cx43分布紊乱情况较前逐步改善，侧对侧连接处T-Cx43表达逐渐减少或消失。大剂量Meto治疗虽然较中小剂量Meto治疗进一步显著改善T-Cx43分布紊乱情况，但明显减少HF大鼠心脏T-Cx43表达。可见，在中小剂量Meto治疗已可改善HF大鼠的心脏电生理紊乱，大剂量Meto治疗显著减少HF大鼠心脏T-Cx43表达的效应可能对心肌细胞电冲动传导速度造成影响，加重传导阻滞的发生。

在Cx43蛋白表达水平的研究中发现在Meto中小剂量治疗组中主要是NP-Cx43表达在T-Cx43表达中比例的增加，而大剂量Meto治疗则对P-Cx43、NP-Cx43表达即T-Cx43表达均有显著抑制。有研究发现在冠脉微栓塞的大鼠动物模型中，Meto可通过抑制心肌细胞凋亡及改善心脏功能来发挥心脏保护作用^[14]。前期在乳鼠心肌细胞中的研究则发现美托洛尔具有独特的维持Cx43去磷酸化状态的作用，且在大鼠在体心肌细胞中发现P-Cx43的表达量与心肌细胞凋亡水平呈显著正相关^{[2, 5]}。本实验结果提示Meto对在体细胞同样有维持Cx43去磷酸化状态的作用，而该作用亦可能与其抗凋亡作用相关。