2015, Vol. 24
中国医学科学院 北京协和医院病理科(贾丛伟、张斌、李锐)，
急诊科(郭树彬)
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)死亡率仍高达30%～40%，积极探索ALI/ARDS分子标志物是急诊医学工作者的重要目标[1]。目前虽然发现20余种与ALI诊断和预后相关的生物标志物[2]，但尚无单个标志物可用于ALI的临床实践。脂钙蛋白2/中性粒细胞明胶酶关联运脂蛋白(LCN2/NGAL)组成性表达于粒细胞并储存于特异性颗粒中，炎症状态下上皮细胞诱导性表达LCN2增加[3]。组织LCN2表达水平与中性粒细胞渗出程度密切相关[4, 5, 6]，LCN2也可提示氧化应激水平[7],在炎症性肺损伤模型中受损肺组织LCN2表达显著增加 [8, 9]。肺上皮细胞凋亡被认为是脓毒症相关ALI发展过程的关键一环[10, 11]，而LCN2在细胞凋亡过程中发挥重要调节作用[12, 13, 14]。脂多糖(LPS)可剂量依赖性引起肺组织表达LCN2增加[15]。这些实验研究提示LCN2可能在脓毒症肺损伤发生中扮演重要角色。多中心临床研究发现血浆NGAL水平能够判断脓毒症患者病情及是否出现多器官损伤[16]。由于脓毒症器官损伤最常累及肺脏，加上LCN2/NGAL具有相对分子量是小、细胞外分泌、抗蛋白酶降解等特点[17]，笔者推测LCN2可能作为脓毒症相关肺损伤的生物标志物。
1 材料与方法 1.1 实验分组与脓毒症模型制备野生型C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华)，12～14周龄，抽签法分为5组(n=10): A组-LPS腹腔内注射(I.P.)(10 mg/kg); B组-LPS(10 mg/kg,I.V.); C组-盲肠结扎穿刺(CLP)(结扎盲肠全长25%); D组-CLP(结扎盲肠全长75%)；对照组中6只鼠仅开腹不做CLP(假手术)和4只仅予生理盐水(NS)(0.3 mL/只，I.V.)。CLP简述为：正中腹部切口1.5 cm，牵出盲肠在相应长度比例部位结扎后以21G不锈钢针在盲肠中部对穿2孔[18]。造模后立即予NS(1.5 mL/只，I.P.，1 次/4 h×4次)。A组、B组和仅注射NS者观察6 h，C组、D组和假手术者观察48 h。
1.2 实验性急性肺损伤的界定反映肺损伤形态和功能性改变的4个“主要特征”(表 1)中有3个或以上出现在同一个体即认为存在急性肺损伤[19]。
| 急性肺损伤的4个主要特征 | 测量指标 | 主要特征的界定标准 |
| 肺泡毛细血管屏障损伤 | (1)TPC of BALF ≥0.4 mg/mL(2)W/D ≥5.5 | (1) + (2)a |
| 肺炎症反应 | BALF 中(3)NC 或(4)IL-6或(5)MPO的水平≥对照组中相应指标测量平均值+2倍标准差 | 至少符合 (3) -(5)项中任何一个 |
| 肺换气障碍 | (6) PaO2≤107 mmHg(7) SaO2＜90%. | (6) 或 (7)b |
| 肺损伤的组织学改变 | (8) 肺泡腔NC≥1/HPF； (9) 肺间质NC≥1/HPF; (10) 肺泡透明膜≥1/HPF; (11)肺泡纤维蛋白碎片≥1/HPF; (12) 肺泡间隔厚度 ≥2 倍正常间隔厚度。 | (8)-(12) 项中至少3项的组合出现在不少于5 HPFs中c |
| 注：BALF 支气管肺泡灌洗液；TPC 总蛋白浓度；W/D 肺湿质量与干质量比值；NC 中性粒细胞计数; IL：白细胞介素；MPO 髓过氧化物酶；PaO2 动脉血氧分压；SaO2 动脉血氧饱和度；HPF 光学显微镜高倍视野。a对照组BALF-TPC和W/D的最大值分别低于0.4 mg/mL 和 5.5； b以PaO2≤对照组PaO2平均值减去2倍标准差或SaO2＜90%界定低氧血症； c每个标本从连续4张切片中选择观察20个HPF。 | ||
观察期结束时经腹主动脉采血行血气分析，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)1.5 mL。结扎右侧主支气管，完整切取右侧3个肺叶置于60°C烘烤72 h计算肺湿质量/干质量比值(W/D)，右下肺叶深低温速冻保存备检mRNA。左肺予固定、包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色。
1.4 蛋白质测定和细胞分类计数使用DC蛋白定量盒(Bio-Rad，美国)检测BALF离心上清液总蛋白浓度。离心沉渣加入0.3 mL PBS悬浮以自动血细胞计数仪(Beckman，美国)测定细胞数量。悬浮液涂片、染色镜检，分类计数300个有核细胞。血清和BALF中特定蛋白质浓度以相应的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定：MPO(Hycult，荷兰)、IL-6和LCN2( R&D，美国)。肺组织中IL-6和LCN2水平以免疫印迹(Western blotting)测定。
1.5 实时定量PCR以TRIzol试剂(Life technology，美国)提取冻存肺组织RNA并完成逆转录。使用power SYBR绿色PCR试剂和ABI PRISM 7300实时PCR仪(Life technology，美国)对逆转录产物中目标基因(IL-6、LCN2)的cDNA水平进行相对定量。
1.6 生存分析42只小鼠随机(随机数字法)分为5组： E 组(n=12)、F组 (n=12)、G 组(n=6)、H组(n=6)分别模拟C组、D组、A组、B组建立脓毒症模型，I组(n=6)为假手术对照组。造模后3 d内予液体复苏，随访7 d。
1.7 统计学方法正态分布计量资料以均数±标准差(x ±s)描述，组间差异计算使用ANOVA方法及Tukey法。偏态分布变量以四分位数范围描述，比较组间差异使用Kruskal-Wallis法及Dunnet’ t法。相关性分析采用Pearson积差相关分析。以Kaplan-Meier法描绘生存曲线并以log-rank法检验生存差异，以P< 0.05为差异具有统计学意义。统计计算与作图采用Prism 5.0统计软件(GraphPad，美国)。
2 结果 2.1 LPS(10 mg/kg，I.V.)与CLP(盲肠结扎比例75%)诱导小鼠实验性肺损伤A组和B组小鼠在注射LPS 3 h内普遍出现立毛、蜷缩、萎靡、反应迟钝、探索和摄食行为停止等大体表现，C组和D组小鼠则在CLP后12～24 h出现类似表现，对照组则无此表现。B组和D组小鼠出现BALF总蛋白和肺W/D显著增加(图 1 A-B)，A、B、D组小鼠BALF和血清的IL-6浓度或中性粒细胞计数显著增加，提示其肺部以及全身炎症反应增强(图 1 C-F)。B组和D组小鼠普遍出现低氧血症和高乳酸血症而其余各组无此表现(表 2)。各组报告具有ALI组织学改变的例数为：A组5例、B组7例、D组8例、C组和对照组各1例。典型ALI改变包括肺间质中性粒细胞聚集和肺泡间隔增厚伴有肺泡少量的红染纤维蛋白样沉积，报告阴性的组织学表现为肺泡壁纤薄且很少发现中性粒细胞聚集与肺泡内蛋白样沉积。B组和D组中缺乏阳性组织学发现的5例由于具备肺泡-毛细血管膜通透性增高、肺部炎症反应增强以及呼吸功能障碍等其他三类证据而视为存在ALI。另一方面，A组和C组虽有6例报告了阳性组织病理学发现，但因其缺乏呼吸功能障碍和肺泡-毛细血管屏障受损的证据而不认为存在ALI。总的来看，无论是LPS注射或者CLP均造成小鼠感染中毒样表现，所以认为各实验组均成功建立脓毒症模型。B组和D组小鼠因为普遍拥有3个或以上的“主要特征”而被确认存在ALI；A组和C组没有一例拥有2个以上的“主要特征”而不认为存在ALI。
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| 支气管肺泡灌洗液(BALF)总蛋白(A)和肺湿质量/干质量比值 (B)用于评价肺泡-毛细血管通透性。髓过氧化物酶(MPO)抗原水平(C)、中性粒细胞计数(D)以及白细胞介素(IL)-6抗原水平(E)作为炎症活动指标。(A)和(B)中数据资料以均数±标准差(x ±s)表示，(C)~(F)中数据资料以四分位数范围表示，与对照组比较ap＜0.01 ，与C组比较bp ＜0.05 ，与A组比较cp ＜0.05 图 1 肺泡-毛细血管屏障损伤与过度炎症反应 |
| 血气参数 | A组(n=10) | B 组 (n=10) | C组(n=10) | D组(n=10) | 对照组(n=10) |
| PaO2 (mmHg) | 123±6 | 102±9abc | 126±7 | 95±7abc | 121±7 |
| SaO2 (%) | 94±4 | 89±2abc | 95±3 | 88±5abc | 96±3 |
| 乳酸(mmol/L) | 1.3[1.1～-1.6] | 2.2[1.8～2.7]a | 1.4[0.8～1.9] | 2.3[1.9～3.2]a | 0.7[0.5～1.1] |
| 注：PaO2：动脉血氧分压; SaO2 ： 动脉血氧饱和度; 腹主动脉穿刺取血后以iSTAT便携式血气分析仪检测。正态分布变量以均数±标准差(x ±s)表示，多组之间比较使用ANOVA方法及Tukey法用于两两比较。偏态分布变量以中位数[四分位数范围]表示，多组之间比较使用Kruskal-Wallis方法及Dunnet’ s法用于两两比较。 ap＜0.01 vs.对照组; bp＜0.05 vs. A组; cp＜0.01 vs. C组。 | |||||
肺损伤小鼠(B组和D组)的血液与BALF中LCN2水平较无肺损伤小鼠(A组和C组)显著增加(图 2 B,D)，但IL-6水平则未表现出类似差异(图 2A,C)。Western blot结果显示脓毒症小鼠肺组织中LCN2和IL-6表达水平显著增加，在有或无肺损伤小鼠之间两种蛋白质的水平差异无统计学意义(图 3A-C)。实时PCR则发现ALI小鼠肺组织LCN2和IL-6的mRNA水平较无ALI者显著增高 (图 3D，E)。
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| 图 2 体液中目标蛋白质浓度 |
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| 图 3 鼠肺脂钙蛋白2(LCN2)与白细胞介素(IL)-6的表达 |
脓毒症小鼠中伴有和不伴肺损伤者之间比较IL-6和LCN2的ELISA测定值分布范围可以发现，IL-6的重叠百分比明显大于LCN2：在BALF中前者为80%而后者为50%；血清中前者为90%而后者为45%。比较检测BALF和血清中两种蛋白质的水平对ALI的诊断能力，检测BALF的LCN2表现最佳(AUC=0.88，P＜0.01)，其具有最高的阳性和阴性预测值(表 3)。 血清和BALF的LCN2水平表现出显著相关性(Spearman r=0.88,P＜0.01)。
| 界值 (ng/mL) | 敏感性 | 特异性 | Youden 指数 | 阳性预测值 | 阴性预测值 |
| BALF LCN2=773 | 95 | 65 | 60 | 73.1 | 92.9 |
| BALF LCN2=1409 | 65 | 95 | 60 | 92.9 | 73.1 |
| 血清LCN2=3026 | 95 | 60 | 55 | 61.3 | 92.3 |
| 血清LCN2=5093 | 70 | 90 | 60 | 87.5 | 75.0 |
| 注：BALF：支气管肺泡灌洗液，LCN2：脂钙蛋白2 | |||||
生存研究发现盲肠结扎比例75%的CLP小鼠在造模84 h内全部死亡，其中绝大部分死亡事件发生在造模后第3天，而盲肠结扎比例25%的小鼠仅有2只死亡(图 4)。静脉注射LPS小鼠均在16 h内死亡，其中最早死亡事件发生在注射后8 h，腹腔内注射LPS小鼠以及接受假手术的对照者则无一例死亡。在7 d观察期结束时，22只存活小鼠中有18只恢复了正常的摄食和探索行为。
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| 图 4 脓毒症小鼠的7 d生存情况 |
脓毒症是ARDS的常见基础病因，目前有许多动物模型用以研究脓毒症相关ALI的发病机制[20]。静脉注射LPS是最早用于建立肺损伤动物模型的方法之一 [10]。CLP建立的动物模型则可较好的模拟人类脓毒症过程，盲肠结扎比例是决定模型动物死亡的重要因素之一 [18]。Iskander等[21]认为ALI不是CLP小鼠急性期死亡的原因，但该研究没有报告盲肠结扎范围，而且术后给予抗生素治疗无疑会减轻脓毒症病情。
炎症状态下核转录因子NF-κB活化可刺激IL-6和LCN2表达增加[22]。IL-6也可直接诱导鼠肝细胞大量合成LCN2[23]，这提示两者的表达调节密切关联，也可以解释本研究中LCN2和IL-6水平的显著相关性。血清和BALF中LCN2和IL-6水平表现出不一致的组间统计学差异，这可能与下列因素相关：(1) IL-6可能被炎症时大量存在的蛋白水解酶降解而LCN2则具有良好的蛋白酶抗性；(2)IL-6的组间差异较LCN2的小很多，以致难以被非参数检验方法发现。肺组织中LCN2和IL-6的基因转录水平和蛋白质表达水平表现出不一致，差异的原因可能是由于呼吸道上皮合成增多的LCN2释放到气道内，致其在BALF中的组间差异显著大于其在肺组织中的组间差异，抑或由于脓毒症时两种基因在转录和翻译水平确实存在不一致。
不少动物研究报道IL-6是脓毒症发生发展的关键炎症介质，并可作为病情和预后的早期标志物[24, 25, 26, 27, 28]，临床上则很少发现其与脓毒症病情相关或作为器官损伤标志物。本研究中IL-6水平不能识别脓毒症相关肺损伤，而LCN2水平则表现出良好的诊断能力，而且LCN2在血清和BALF中的水平表现出良好的相关性，示其具备作为器官损伤标志物的基本条件，即：标志物蛋白在生物体液中的质量浓度与它们在损伤部位的表达水平密切相关[29]。临床上获取BALF存在一定的风险且标本收集难以标准化，而血样容易获取也容易满足标准化检测要求。本研究中血清和BALF中LCN2水平表现出显著相关性以及对脓毒症相关肺损伤相似的诊断能力，于临床实践而言具有重要提示意义，值得深入研究证实。
本研究存在局限之处：由于对小动物连续取样存在技术性困难以及对实验性肺损伤定量研究缺乏可靠的方法学支持，由于不清楚LCN2表达水平是否反映器官损伤的程度，也没有研究ALI过程中LCN2的时相变化特点。此外，有必要更多阐明LCN2参与肺损伤发生的具体机制。
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