在严重感染、脓毒症等所致应激状态下,无糖尿病病史的患者出现应激性高血糖的发生率约为50%。机体感染后出现血糖升高,胰岛β细胞损伤是其重要原因[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分,其作用类似于内毒素。Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)是作为LPS受体复合体的跨膜成分,在很多细胞中发挥作用,尤其是在免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞中TLR4高表达。但在胰岛素敏感的细胞如脂肪细胞和肌细胞中,也有内源性TLR4的表达[2]。前期研究发现胰岛β细胞株INS-1表达TLR4[3],本研究进一步探讨大鼠胰岛组织中TLR4的表达及LPS对其表达的影响,以期发现应激性高血糖的可能内分泌机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组SPF级6~8 周雄性SD大鼠20只,体质量250~300 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。大鼠腹腔内注射LPS 5 mg/kg,间隔3 h注射第2次,制备脓毒症模型。大鼠随机(随机数字法)分为正常对照组、LPS组(即脓毒症组)、抗TLR4抗体组和抗TLR4抗体+LPS组。对照组在相同时点注射无菌 等容积生理盐水;抗TLR4抗体组尾静脉注射抗TLR4 单克隆抗体(500 μg/kg),间隔3 h注射第2次;抗TLR4抗体+LPS组:每次LPS注射前15 min尾静脉注射抗TLR4 单克隆抗体500 μg/kg。
1.2 主要试剂LPS(Sigma公司,美国);TLR4抗体(Santa Cruz公司,美国),辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记山羊抗鼠二抗(CST公司,美国),SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德),胰岛素放免试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories公司,美国),Surestep Life scan血糖仪及试纸(强生公司,美国),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物科技),PCR试剂盒(TaKaRa公司,日本),引物合成:上海英骏生物技术有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)大鼠给药处理6 h后行葡萄糖静脉试验评估胰岛β细胞分泌功能。从大鼠腹股沟处依次切开皮肤、皮下筋膜,分离出股静脉,结扎静脉远端后剪开一小口,插入三通导管,抽取空腹血后,推入50%葡萄糖(0.5 g/kg),于5、10、30、60、120 min分别采血1 mL,即刻测定静脉全血葡萄糖,余血标本分离出血清,贮于-20 ℃冰箱待测胰岛素。试验期间于各点采血后,输入同等量的0.9%生理盐水以保持血容量恒定,并定时推入肝素(100 U/mL)抗凝。静脉葡萄糖试验结束后即刻处死大鼠,取胰尾组织,保存于-80 ℃,供免疫组化及提取蛋白、RNA检测。
1.3.2 大鼠原代胰岛组织中TLR4 mRNA的表达采用SYBR Green PCR试剂盒检测,TLR4引物:上游5’ -TTCCTCTCCTGC GTGAGAC-3’ ;下游5’ -TTCATAGGGTTCA GGGACAG -3’ 。GAPDH:上游5’ -TGAAGGTCGGTGTGAACGGAT-3’ ;下游5’ -CAGGGGGGCTAAGCAGTTG GT-3’ 。25 μL体系,反应条件:94 ℃5 min;94℃ 30 s;67 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃10 min。采用ABI2720软件进行结果分析。
1.3.3 胰岛组织TLR4蛋白的表达取1 g左右胰腺组织,提取蛋白,用BCA法测定蛋白质浓度,蛋白保存于-80 ℃。电泳前按4∶ 1体积与上样缓冲液混合,沸水变性10 min,于10%聚丙烯酰胺 凝胶电泳。转膜后5%脱脂奶粉封闭1 h,按1∶ 1000 加入TLR4一抗,4 ℃孵育过夜。TBST冲洗10 min×3次,按1∶ 2000加入HRP标记山羊抗鼠二抗,室温孵育1 h,TBST冲洗10 min×3次,显色。Image Lab软件分析条带灰度值。
1.3.4 TLR4的免疫组化检测用SABC法,胰岛组织切片脱蜡、封闭、抗原热修复;滴加TLR单克隆一抗(稀释度为1∶ 100);滴加HRP标记山羊抗鼠二抗,滴加SABC试剂,DAB显色;复染;封片。镜下观察TLR4染色阳性反应物质呈棕色。
1.4 计算方法胰岛素、血糖曲线下面积计算(AUC):采用近似梯形的计算公式,如0~10 min血糖AUC=1/2 (0 min值+10 min值)+5 min值;0~120 min胰岛素AUC=1/2(0 min值+120 min值)+5 min值+10 min值+30 min值+60 min值。
1.5 统计学方法
SPSS 19.0 软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(x ±s)表示。两组间比较成组t检验,组间比较用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 大鼠胰岛TLR4的表达胰腺组织切片免疫组织化学染色后,免疫阳性反应物质显色为棕色,在大鼠胰岛细胞细胞质中呈弥散性分布。正常组大鼠胰岛细胞有TLR4表达,呈浅棕色,见图 1A。LPS 处理大鼠6 h后,胰岛可见较多阳性细胞,呈深棕色,见图 1B,胰岛组织中TLR4的表达升高,TLR4蛋白相对表达量为(0.80±0.69),与对照组(0.37±0.40)相比,显著升高(P<0.01),见图 2、图 3;mRNA表达为(2.87±3.72),与对照组(1.00±1.20)相比,表达增加有统计学意义(P<0.01),见图 4。单独抗TLR4抗体不影响TLR4的表达(P>0.05),大鼠提前注射抗TLR4后用LPS刺激,大鼠胰岛组织阳性细胞较LPS组少,呈浅棕色,见图 1C、图 1D;LPS诱导的TLR4蛋白及mRNA水平的升高均被抑制,差异具有统计学意义(P<0.01),见图 2、图 3、图 4。
2.2 LPS对大鼠胰岛素分泌功能的影响 2.2.1 血糖
大鼠行静脉葡萄糖试验,LPS组与正常对照相比在10、30、60、120 min大鼠的血糖明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。
抗TLR4抗体干预后,与LPS组相比能降低30~120 min血糖的 升高(P<0.01),抗TLR4抗体能改善LPS诱导的血糖异常。LPS处理后,胰岛素分泌降低,与正常对照组相比,30、60、120 min差异具有统计学意义(P<0.01),抗TLR4抗体干预后能改善LPS对胰岛素分泌的抑制(P<0.01),见图 5、表 1。
组别 | 时间(min) | |||||
0 | 5 | 10 | 30 | 60 | 120 | |
正常对照组 | ||||||
血糖值(mmol/L) | 4.49±0.43 | 17.02±1.06 | 14.77±0.71 | 6.27±0.87 | 4.07±0.74 | 4.83±0.64 |
胰岛素(μIU/mL) | 10.28±0.78 | 11.21±1.19 | 12.81±1.12 | 36.11±1.31 | 38.81±1.10 | 39.04±1.10 |
血糖AUC | 26.65±1.46 | 37.17±1.95 | 42.34±2.51 | 46.79±3.05 | ||
胰岛素AUC | 22.75±1.58 | 47.21±1.70 | 84.67±1.74 | 123.60±1.86 | ||
LPS组 | ||||||
血糖值(mmol/L) | 5.25±0.78 | 18.43±1.20 | 16.57±1.15 | 10.79±0.93 | 6.50±0.59 | 7.06±0.50 |
胰岛素(μIU/mL) | 11.16±0.65 | 11.33±1.21 | 12.17±1.05 | 15.40±1.14 | 18.09±0.99 | 18.84±1.02 |
血糖AUC | 29.34±1.49 | 43.01±1.78 | 51.66±1.71 | 58.44±1.89 | ||
胰岛素AUC | 22.99±1.78 | 36.78±2.60 | 53.52±2.58 | 71.99±1.73 | ||
抗TLR4抗体组 | ||||||
血糖值(mmol/L) | 4.04±0.38 | 17.38±0.72 | 15.27±0.51 | 7.26±0.68 | 4.43±0.44 | 4.72±0.77 |
胰岛素(μIU/mL) | 9.80±0.96 | 11.60±0.64 | 12.93±1.18 | 34.99±1.88 | 37.90±0.95 | 38.96±0.97 |
血糖AUC | 27.04±0.90 | 38.03±1.37 | 44.14±1.88 | 48.71±2.41 | ||
胰岛素AUC | 22.97±1.01 | 46.93±1.64 | 83.37±1.92 | 121.81±1.86 | ||
LPS+抗TLR4抗体组 | ||||||
血糖值(mmol/L) | 4.83±0.60 | 18.14±0.67 | 15.50±0.71 | 8.03±0.89 | 4.61±0.62 | 5.26±0.43 |
胰岛素(μIU/mL) | 10.06±0.79 | 11.19±1.12 | 13.33±0.98 | 33.14±1.12 | 36.08±1.10 | 37.10±1.03 |
血糖AUC | 28.30±1.13 | 40.07±1.87 | 46.39±2.58 | 51.32±3.03 | ||
胰岛素AUC | 22.89±1.12 | 46.13±1.03 | 80.74±1.16 | 117.33±1.70 |
0~10 min(29.34±1.49) vs. (26.65±1.46),P<0.05;0~30 min(43.01±1.78) vs. (37.17±1.95),P<00.01;0~120 min(58.44±1.89)vs. (46.79±3.05),P<00.01,即LPS组均大于正常对照组;0~30 min(40.07±1.87)vs.(43.01±1.78),P<00.05;0~120 min(51.32±3.03)vs.(58.44±1.89),P<00.01;LPS+抗TLR4抗体组均小于LPS组。胰岛素曲线下面积:0~30 min(36.78±2.60)vs.(47.21±1.70),0~120 min(71.99±1.73)vs.(123.60±1.86)LPS组均小于正常对照组(P<00.01);0~30 min(46.13±1.03)vs。(36.78±2.60)、0~120 min(117.33±1.70)vs.(71.99±1.73)LPS+抗TLR4抗体组均大于LPS组(P<00.01)。见表 1。
3 讨论重症感染患者多存在应激性高血糖,高血糖的发生与感染后神经—内分泌系统激活和炎性介质过度释放有关,机体存在高分解代谢和胰岛素抵抗,而感染患者急性血糖升高能使机体血中胰岛素和炎性细胞因子急剧增加[4],血糖的异常与患者的病情进展和预后密切相关。传统观点认为LPS可促进炎症因子(如IL-1、TNF-α)和其他活性分子的合成及释放,从而间接影响胰岛β细胞。有学者发现,联合应用LPS、TNF-α和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)处理新鲜分离的人和大鼠胰岛组织,可使位于胰岛的巨噬细胞活化,产生内源性IL-1,引起胰岛β细胞功能损害。MODS大鼠血糖的升高与胰岛β细胞的损害及胰岛素分泌不足相关,机制可能与出现大量自由基、炎症介质损伤及胰腺微循环障碍、炎症细胞浸润有关[5]。2型糖尿病的人和动物胰岛中表达TLR4的巨噬细胞浸润增加,TLR4的表达和胰岛素抵抗的加重密切相关[6],肥胖和2型糖尿病小鼠的胰岛中TLR4和炎症因子如白介素-6(interleukin-6,IL-6)表达升高[7]。但LPS是否可直接作用于胰岛β细胞,并导致其功能障碍尚不明确。有文献证实[3, 8],人、大鼠原代胰岛β细胞和HP62细胞株表面有TLR4表达;但研究LPS注射后的脓毒症大鼠胰岛上TLR4表达的调节及其对胰岛素分泌的影响报道较少。
研究证实INS-1细胞株上有TLR4的表达,LPS对INS-1细胞活力有抑制作用,LPS可能通过INS-1细胞表面的TLR4诱导其发生氧化应激甚至凋亡[9]。但与细胞株比较,体内实验和原代细胞更能模拟机体的生理和病理状态,其变化能反映严重感染时机体应激性血糖升高的机制。因此,本研究通过制备脓毒症大鼠模型,从体内实验观察LPS的直接作用对胰岛中TLR4表达的影响。
已确认的TLRs家族成员在人类有10个、在小鼠有13个。人和大鼠胰岛细胞中表达CD14和相关分子如TLR4、TLR2和Mb2。Liang等[10]发现TLR4通过加重氧化应激介导肥胖及糖尿病相关的内皮功能损伤,敲除TLR4基因可以保护小鼠对抗肥胖诱导的胰岛素抵抗。有学者用100 μg/L LPS刺激BRIN-BD11细胞株,24 h后该β细胞株的胰岛素分泌显著下降[11]。本实验结果进一步证实,原代胰岛细胞上存在TLR4的表达,在一定作用时间和刺激浓度范围内,LPS刺激可上调其受体TLR4蛋白和基因的表达,使分泌胰岛素功能明显受到抑制。LPS刺激的脓毒症大鼠采用静脉注射葡萄糖后,血糖显著升高,没有出现明显的胰岛素分泌高峰,上述研究结果说明LPS可以配体形式直接作用于胰岛β细胞的TLR4,进一步导致细胞功能障碍,胰岛素分泌抑制,这一现象可部分解释感染后应激性高血糖的发生。研究采用TLR4抗体阻断LPS作用后,观察到与LPS组相比能降低30~120 min血糖的升高(P<0.01),改善LPS诱导的血糖异常,胰岛素分泌功能有改善,进一步说明LPS通过对胰岛细胞的表面TLR4的直接作用,影响细胞功能。抑制TLR4可通过阻断炎性反应过程,导致异体移植的胰岛存活[12]。此外,胰岛β细胞中还表达同样能识别LPS的TLR2,细菌产物可以上调该受体,并增加免疫系统对感染的应答[13]。因此,本研究中LPS刺激后血糖升高、胰岛素分泌障碍可能有部分TLR2参与,其作用机制可能与放大LPS作用后的TLR4信号途径有关,具体机制有待进一步研究探讨。
[1] | Preissig CM, Rigby MR. Hyperglycaemia results from beta-cell dysfunction in critically ill children with respiratory and cardiovascular failure: a prospective observational study [J]. Crit Care, 2009, 13(1): R27. |
[2] | Reyna SM, Ghosh S, Tantiwong P, et al. Elevated toll-like receptor 4 expression and signaling in muscle from insulin-resistant subjects [J]. Diabetes, 2008, 57(10): 2595-2602. |
[3] | Fundova P, Funda D, Osterbye T, et al. Functional expression of CD14 and Toll-like receptors on subsets of islet β cells [J]. Clin Immunol, 2008, 127(suppl 1): S12. |
[4] | 虞文魁, 李维勤, 李宁, 等. 急性高血糖对感染患者激素和细胞因子的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2005, 14(2): 132-135. |
[5] | 石松菁, 林才经, 林兴盛. 多器官功能障碍综合征大鼠胰岛β细胞超微结构和功能的改变[J]. 中华急诊医学杂志, 2009, 18(10): 1026-1030. |
[6] | Ehses JA, Perren A, Eppler E, et al. Increased number of islet-associated macrophages in type 2 diabetes [J]. Diabetes, 2007, 56(9): 2356-2370. |
[7] | Ladefoged M, Buschard K, Hansen AM. Increased expression of toll-like receptor 4 and inflammatory cytokines, interleukin-6 in particular, in islets from a mouse model of obesity and type 2 diabetes [J]. APMIS, 2013, 121(6): 531-538. |
[8] | Garay-Malpartida HM, Mouro RF, Mantovani M, et al. Toll-like receptor 4 (TLR4) expression in human and murine pancreatic beta-cells affects cell viability and insulin homeostasis [J]. BMC Immunol, 2011, 12:18. |
[9] | Ge QM, Du SC, Bian F, et al. Effects of lipopolysaccharides on TLR4 expression in INS-1 rat insulinoma cells [J]. Cell Mol Biol, 2011, 57(Suppl): 1513-1519. |
[10] | Liang CF, Liu JT, Wang Y, et al. Toll-like receptor 4 mutation protects obese mice against endothelial dysfunction by decreasing NADPH oxidaseisoforms 1 and 4 [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013, 33(4):777-784. |
[11] | Kiely A, Robinson A, Mc Clenaghan NH, et al. Toll-like receptor agonist induced changes in clonal rat BRIN-BD11 beta-cell insulin secretion and signal transduction [J]. J Endocrinol, 2009, 202(3): 365-373. |
[12] | Goldberg A, Parolini M, Chin BY, et al. Toll-like receptor 4 suppression leads to islet allograft survival [J]. FASEB J, 2007, 21(11): 2840-2848. |
[13] | Vives-Pi M, Somoza N, Fernandez-Alvarez J, et al. Evidence of expression of endotoxin receptors CD14, toll-lokr receptors TLR4 and TLR2 and associated molecule MD-2 and of sensitivity to endotoxin (LPS) in islet beta cells [J]. Clin Exp Immunol, 2003, 133(2): 208-218. |