2015, Vol. 24
脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征，病情凶险，病死率高。目前，脓毒症的全球病死率高达30%～70%，脓毒症的高发病率与病死率逐渐成为威胁人民健康的全球性问题之一。最新美国国家卫生研究院资料显示，在美国ICU毎年大约有70万至90万脓毒症患者入院，其中大约有20万患者死于脓毒症。目前脓毒症确切的发病机制尚未完全阐明，有大量的研究表明，细菌内毒素、失控的炎症反应、凝血功能紊乱、免疫功能紊乱、细胞凋亡、血管内皮细胞功能障碍、高代谢状态、基因多态性等因素与其发病机制均密切相关。促血管生成素 (angiopoietin,Ang)是一个与新生血管生成密切相关的家族，近期的研究显示细菌内毒素可以调控Ang系统，影响脓毒症的血管内皮细胞功能，破坏血管内皮完整性，导致毛细血管通透性增加，最终引起多器官功能障碍和衰竭[1]。因此，Ang系统在脓毒症的发生和发展过程中发挥了重要作用。
1 Ang的编码基因、结构和表达目前，已知Ang家族包括Ang-1 、Ang-2、 Ang-3 和Ang-4四个成员，主要在胚胎发育期表达，促进心血管系统的发育成熟，其中，Ang-1和Ang-2与血管生成的关系较为密切。成年以后，除在女性生殖系统(卵巢、子宫)表达水平较高外，在其他组织呈低水平表达。Ang各成员的蛋白结构基本相同，都由3部分组成：N-端疏水性分泌信号肽、α-螺旋的卷曲结构域及C-纤维蛋白原样结构域。卷曲结构域主要促进蛋白分子的多聚化；C-端纤维蛋白原样结构域是Ang中最具保守性的一部分，其中包含受体结合部分，决定某种Ang是否起激动作用。
1.1 Ang-1，Ang-2的编码基因、结构和表达人的Ang-1基因位于染色体8q22.3-23，包括9个外显子和8个内含子，其相对分子质量约为60 000～75 000。 Ang-1是由498个氨基酸组成的同源六聚体，其卷曲结构域大约180个氨基酸，呈四面体结构，与肌球蛋白有弱的同源性；其C-纤维蛋白原样结构域大约有200个氨基酸，与纤维蛋白原、tenascin、hfrep、 ficolin 及果蝇的SCABROUS有相似性，与受体的结合及磷酸化有关。胚胎心血管发育早期Ang-1主要在包绕心内膜的心肌上表达，后期则在血管周细胞上表达。其表达受缺氧、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等的调控。
Ang-2基因位于染色体8p21，编码496个氨基酸，与Ang-1有60%的同源性，主要区别在于曲卷结构域和与纤维蛋白原样结构域的交界处比Ang-1少一个半胱氨酸，导致了其生物学功能完全不同[2]。Ang-2是一种分泌性蛋白，主要由血管内皮细胞分泌产生，也可由肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等表达。在胚胎发育期Ang-2主要在大血管平滑肌，以及成体子宫和胎盘等血管生成活跃的组织表达[3]。病理情况下主要表达于肿瘤、炎症、创伤等部位。其表达受多种因子如血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、EGF、碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、血管紧张素Ⅱ、凝血酶等的影响。雌激素、缺氧等可促进Ang-2的表达，而Ang-1、TGF-β则下调其表达水平[4, 5]。
1.2 Ang家族的其他成员Ang家族中另外两个研究较少的成员Ang-3和Ang-4，是分别从鼠、人的标本中分离得到的两种蛋白，是同一基因座基因的不同译本。此两种促血管生成素分布于不同的组织：Ang-3在小鼠体内的多种组织中均有分布，约503个氨基酸，与Ang-1、Ang-2分别有45.1%和44.7%的同源；而Ang-4则主要在人的肺中高表达[6]。
2 Ang的作用途径Ang作用于内皮特异性含免疫球蛋白样环和上皮生长因子样域酪氨酸激酶-2受体(tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain2，Tie-2) ，与其结合后使Tie-2磷酸化，后通过一系列复杂的信号发挥其生物功能，维持成熟血管的完整性及静息状态，并参与生理及病理情况下，如月经周期、脑卒中、伤口愈合、感染、肿瘤发生等的血管新生。
2.1 Tie-2的编码基因、结构和表达Tie-2的基因定位于染色体9q31，全长109 000，编码1122个氨基酸。Tie-2蛋白为跨膜蛋白质，胞外区由2个免疫球蛋白样片段和3个富半胱氨酸区组成，胞内区含保守的酪氨酸。Fiedler等[7]研究发现第1个免疫球蛋白样区和3个表皮生长因子样区是与Ang-1、Ang-2结合的主要区域，单独的免疫球蛋白样区域或3个表皮生长因子样区是无法与配体结合的。Tie-2主要表达在胚胎时期血管内皮细胞及成年动物的肺血管及卵泡、创口肉芽组织等血管生成活跃的血管内皮细胞。除内皮细胞外，在早期造血细胞也有表达，提示人的造血微环境和血管新生之间存在重要联系。
2.2 Ang与其受体Tie-2的作用机制Tie-2受体是一个与新生血管形成密切相关的内皮细胞蛋白激酶家族。Ang-1和Ang-2均能与Tie-2结合，但是表现为不同的效应：Ang-1能激活Tie-2而Ang-2抑制其生物活性，这主要与两者的结构差异有关：Ang-1多数形成多聚体，少数形成三聚体；而Ang-2则易形成二聚体，少数形成多聚体[8]。
Ang-1作为Tie-2受体的天然激动剂，它与Tie-2特异性结合，促进血管内皮细胞Tie-2受体的磷酸化，从而促进新生血管的成熟和稳定。Ang-2亦可以与Tie-2受体结合，但被认为是Tie-2受体的天然拮抗剂，内皮细胞中的Ang-2与Tie-2结合后，Tie-2可能与Tie-1或其他膜表面分子形成二聚体，抑制胞浆的酪氨酸激酶相互作用，不能促进血管内皮细胞Tie-2受体的磷酸化，从而竞争性阻止Ang-1激活Tie-2受体。需指出的是Ang-2不能使内皮细胞Tie-2受体活化，但可使平滑肌细胞和NIH 3T3成纤维细胞的Tie-2受体磷酸化，即Ang-2除了拮抗作用外，还有激动的作用，其激动具体机制和激动后的调控途径等有待进一步研究。
研究表明，Ang-4可以磷酸化Tie-2，而Ang-3不仅不能磷酸化Tie-2，并且在人内皮细胞中它会抑制Ang-1引起的Tie-2受体的磷酸化。接下来的研究证明Ang-3和Ang-4二者均是Tie-2受体信号的拮抗剂，而其中Ang-3是Tie-2的特异性配体；与这个发现相反的是，体内实验发现Ang-3和Ang-4均可诱导血管生成[9]。目前，关于Ang-3和Ang-4对血管生成作用的研究还存在争议。
3 Ang与内皮细胞功能血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)是体内重要的代谢和内分泌器官之一，具有多种生物活性，在调节凝血、细胞黏附、营养交换、血管紧张度以及局部促炎和抗炎介质平衡方面发挥重要作用。大量文献显示，微血管内皮功能紊乱在脓毒血症及其休克中起着极其关键的作用，而内毒素是引起微血管内皮功能紊乱的确切因子。大量的临床和实验室资料认为，内毒素环境下，微血管内皮功能结构和功能会发生改变，微血管内皮细胞不仅是一个靶器官，而且能进一步促进全身系统性炎症反应(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，多器官功能障碍(multiple organ dysfanction syndrome,MODS)等的发展[10]。微血管内皮细胞被激活、损伤以及功能障碍的出现是脓毒症导致MODS的重要环节[11]。
Ang-1通过旁分泌作用，与附近血管内皮细胞膜上的Tie-2受体特异性结合后，引起Tie-2磷酸化，激活下游的PIP3/AKT激酶途径，再通过进一步的信号转导引起生物学效应[12]，引起内皮细胞移行，该信号转导途径被认为是细胞移行的分子机制之一。Ang-1的C-纤维蛋白原样结构域大约有200个氨基酸，与纤维蛋白原、tenascin、hfrep、ficolin及果蝇的SCABROUS有相似性，与受体的结合及其磷酸化有关。Ang-1可抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞生存并减少血管的萎缩和退化，Ang-2通过竞争性抑制Ang-1与Tie-2的结合，从而形成不稳定的血管，表现为毛细旁细胞，周细胞(pericyte)密度减少、内皮细胞之间及其与支持细胞之间的连接、介导基质与原有血管基底膜裂解，破坏毛细血管完整性，毛细血管通透性增加等现象，也就是毛细血管内皮功能紊乱，从而引起脓毒症。由此可见，Ang-1和Ang-2在脓毒症的发生、发展过程中起着不可或缺的作用。
4 Ang在脓毒症中的作用 4.1 Ang在脓毒症中诊断和病情评估目前我们面临主要问题是缺乏对脓毒症早期诊断及其预测其疾病发展的临床生化检验指标。最近文献报道大约有178种生化标志可以在脓毒症血液中检测到，其中包括C反应蛋白及促血管生成素2 (angiopoietin-2)。2006年Parikh 等[13]报道急性重度脓毒症患者血浆中促血管生成素2含量显著高于中度脓毒症患者血浆含量，促血管生成素-1的水平没有明显变化，促血管生成素-1/2比值上调程度明显与脓毒症患者的严重程度相关。
大量临床研究表明(见表 1)，脓毒症患者体内的Ang-2水平是增加的[14, 15]，这可能与感染后细菌内毒素促进Ang-2的释放有关。脓毒症患者体内Ang-2水平增高与疾病严重程度和内皮细胞活化程度呈正相关，而与内皮细胞一氧化氮生物利用率呈负相关。Ang-1、Ang-2的含量比例失衡，尤其是Ang-2/Ang-1比值增高是检验毛细血管内皮功能的重要指标[16]，也被认为是脓毒症休克患者最有前景的生物标记物[17]。Luz Fiusa等[18]发现Ang-2/Ang-1比值增高可增加中性粒细胞减少的患者出现脓毒症休克的风险。Ang-2与Tie-2受体竞争性结合并且破坏内皮屏障保护功能，因此，Ang-2可能是反映脓毒症患者内皮细胞功能及判断预后的重要的生物标记物，可用于脓毒血症早期诊断及预测其疾病发展的临床生化重要检验指标。近期研究显示，Ang-1和Ang-2可作为儿童严重脓毒症的诊断标志物[19]。此外，Ang-1和Ang-2还可以早期预测脓毒症患者肺损伤的发生，另有前瞻性试验发现发病早期(12 h)明显升高的Ang-2对判断严重脓毒症渗漏性水肿的形成有一定的临床价值。Ang-2不仅是一个脓毒血症诊断指标，同时也是诱发器官损伤的重要介质。在脓毒症患者中，增加的Ang-2可能是促进多器官衰竭引起休克及死亡的重要原因。Ang/Tie-2信号系统与脓毒血症有着千丝万缕的关联，对于这一疾病的发生、发展和机理研究具有很高的价值。尤其是深入对Ang-1蛋白功能及其作用机制的研究，将为脓毒血症患者微血管内皮功能紊乱的治疗提供极具优势的理论及实验依据。
| 作者 | 背景 | 研究人数 | 主要发现 | 年份 |
| Parkinh | ICU, sepsis | 22 | ●Angpt-2↑in severe sepsis ●Angpt-2↑with Low P/F ratio | 2006 |
| Orfanos | ICU, sepsis | 13-18 | ●Angpt-2↑in severe sepsis ●Angpt-2 correlate with TNF | 2007 |
| Giuliano | Pediatric ICU, Sepsis | 61 | ●Angpt-2↑at ICU admission in septic shock>sepsis>SIRS ●Angpt-1↓in septic shock | 2007 |
| Van der Heijden | ICU, sepsis | 22 | ●Angpt-2↑in sepsis ALI ●Angpt-2↑correlate with measures of pulmonary vascular leakage | 2008 |
| Giamarellos-Bourboulis | ICU, trauma, sepsis | 16 with trauma and sepsis | ●Angpt-2↑upon advent of sepsis and correlate with adverse outcomes | 2008 |
| Kuempers | ICU, sepsis | 43 | ●Angpt-2↑health | 2008 |
| Siner | ICU, sepsis | 24 | ●Angpt-2 in septic non-survivors > septic survivors ●Angpt-2 correlate with IL-6 and severity of illness | 2009 |
| Kuempers | ICU, sepsis | 21 in ICU | ●In ICU, Angpt-2↑in future non-survivors | 2009 |
| LPS Trial | 22 in LPS | ● IN LPS infusion, Angpt-2 peaks in 4.5h | 2009 | |
| Van der Heijden | ICU, septic shock | 50 | ●Angpt-2 correlate with fluid balance and pulmonary dysfunction | 2009 |
| Ebihara | ICU, septic shock | 12 | ●Angpt-2↑in septic shock non-survivors ●Angpt-1↓in septic non-survivors | 2010 |
| Davis | ICU, wards, sepsis | 83 | ●Angpt-2↑propotional to sepsis severity ●Angpt-2 inversely to NO dependent vasoreactivity | 2010 |
| Mankhamb | Pediatric ICU, wards, Sepsis | 293 | ●Angpt-2↑in future non-survivors ●Angpt-1↓in future non-survivors in multivariate analysis, ↓Ang-1 associate with mortality | |
| Riccuiuto | ICU, sepsis | 70 | ●Angpt-1↓at ICU admission associated with mortality ●Angpt-2 correlate with clinical severity and endothelial markers | 2011 |
基于上述的Ang-Tie功能，提高体内Ang-1水平、降低Ang-2水平可能成为脓毒症治疗的潜在靶点。研究显示，动物实验中给予外源性的Ang-1可以有效地改善脓毒症肺损伤的炎症反应及血管渗漏，并提高其生存率[20, 21]。Ang-2介导的微血管功能损伤可能是导致脓毒症及休克的重要原因，因此抑制Ang-2/Tie-2的相互作用成为治疗脓毒症的新靶点[22]。Ang-2的抗体及其拮抗剂可抑制Ang-2与其受体Tie-2的结合，从而减轻Ang-2导致微血管内皮功能紊乱的作用，延缓脓毒血症的进展，成为脓毒血症及其休克治疗的有效途径，具有很好的治疗前景。目前已有部分Ang-2阻断剂已经用于临床Ⅱ期和Ⅲ期试验，其中，PeptiBody-AMG356可特异性阻断Tie-2受体，从而抑制Ang-1及Ang-2的生物学作用。该药目前已经完成临床Ⅱ期试验，表明其安全有效，对于卵巢癌症及其复发有着显著的疗效。CoxV-Body CVX-o6o是一种Ang-2特异性拮抗剂，此药目前正在进行Ⅱ期临床试验，评估其疗效及其有效治疗剂量。动物实验表明，通过RNA干扰技术封闭Ang-2的作用，可使脓毒症小鼠模型的肺损伤和肺水肿明显减轻[23]。此外，研究表明，通过RNA干扰技术可以减少脓毒症的病死率和多功能器官衰竭发生率[24]，并且这种方法比封闭抗体具有更高的稳定性。脓毒症诱发肺损伤的病理生理机制及治疗方法还未完全阐明，高剂量白介素2(high-dose interleukin 2 therapy,HDIL-2)是治疗恶性肿瘤的重要方法，但在脓毒症导致的全身炎症反应综合征及肺水肿的治疗上有限；IL-2可刺激Ang-2的分泌，从而增加了内皮细胞的不稳定性，导致肺水肿，Gores等[25]发现经HDIL-2治疗后，血浆中Ang-2浓度的增高与脓毒症患者的肺损伤密切相关。
综上所述，内皮细胞活化和损伤以及功能障碍在脓毒血症的发生和发展过程中发挥着极其重要的作用，同时内皮也是导致炎症反应的主要靶器官，如何保护内皮细胞，会对临床上寻找脓毒血症治疗的新方法提供理论依据。近年来有关Ang的大量实验室研究结合临床药物试验表明，Ang可通过干扰内皮细胞功能，从而在脓毒血症及休克中发挥重要作用。深入研究Ang-Tie的生物学效应及信号转导机制，可为脓毒症的发病机制提供新思路；通过对Ang抗体及其拮抗剂等的临床应用，期望为脓毒血症及休克的治疗提供新途径。
| [1] | Gyawali N, Sanjana RK .Bacteriological profile and antibiogram of neonatal septicemia[J]. Indian J Pediatr,2013, 80(5): 371-374. |
| [2] | Kim KT, Choi HH, Steinmetz MO, et al. Oligomerization and multimerization are critical for angiopoietin-1 to bind and phosphorylate Tie2[J]. J Biol Chem, 2005, 280(20): 20126-20131. |
| [3] | Krikun G, Schatz F, Finlay T, et al. Expression of angiopoietin-2 by human endometrial endothelial cells: regulation by hypoxia and inflammation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2000, 275(1): 159-163. |
| [4] | Pichiule P, Chavez JC, LaManna JC. Hypoxic regulation of angiopoietin-2 expression in endothelial cells[J]. J Biol Chem,2004, 279(13): 12171-12180. |
| [5] | Sfiligoi C, de Luca A, Cascone I, et al. Angiopoietin-2 expression in breast cancer correlates with lymph node invasion and short survival[J]. Int J Cancer, 2003, 103(4): 466-474. |
| [6] | Tsigkos S, Koutsilieris M, Papapetropoulos A.Angiopoietins in ngiogenesis and beyond[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2003, 12(6): 933-941. |
| [7] | Fiedler U, Krissl T, Koidl S, et al. Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 share the same binding domains in the Tie-2 receptor involving the first Ig-like loop and the epidermal growth factor-like repeats[J]. J Biol Chem,2003, 278(3)): 1721-1727. |
| [8] | Ward EG, Grosios K, Markham AF, et al.Genomic structures of the human angiopoietins show polymorphism in angiopoietin-2[J]. Cytogenet Cell Genet, 2003, 94(3/4): 147-154. |
| [9] | Lee HJ, Cho CH, Hwang SJ, et al. Biological characterization of angiopoietin-3 and angiopoietin-4[J]. FASEB, 2004, 18(11): 1200-1208. |
| [10] | Lee WL, Liles WC .Endothelial activation, dysfunction and permeability during severe infections[J]. Curr Opin Hematol, 2011, 18(3): 191-196. |
| [11] | Minamino T, Miyauchi H, Yoshida T,et al.Endothelial cell senescence in human atherosclerosis: role of telomeres in endothelial dysfunction[J]. J Cardiol, 2003, 41(1): 39-40. |
| [12] | Jones N, Chen SH, Sturk C, et al. A unique autophosphorylation site on Tie2/Tek mediates Dok-R phosphotyrosine binding domain binding and function[J]. Mol Cell Biol, 2003, 23: 2658-2668. |
| [13] | Parikh SM1, Mammoto T, Schultz A, et al. Excess circulating angiopoietin-2 may contribute to pulmonary vascular leak in sepsis in humans[J]. PLoS Med,2006, 3(3): e46. |
| [14] | Calfee CS, Gallagher D, Abbott J, et al. Plasma angiopoietin-2 in clinical acute lung injury: prognostic and pathogenetic significance[J]. Crit Care Med, 2012, 40(6): 1731-1737. |
| [15] | Kumpers P, van Meurs M, David S, et al. Time course of angiopoietin-2 release during experimental human endotoxemia and sepsis[J]. Crit Care, 2009, 13(3): R64. |
| [16] | Ricciuto DR, dos Santos CC, Hawkes M, et al. Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 as clinically informative prognostic biomarkers of morbidity and mortality in severe sepsis[J]. Crit Care Med, 2011, 39(4): 702-710. |
| [17] | Kumpers P, Lukasz A, David S,et al. Excess circulating angiopoietin-2 is a strong predictor of mortality in critically ill medical patients[J].Crit Care, 2008, 12(6):R147. |
| [18] | Luz Fiusa MM, Costa-Lima C, de Souza GR, et al. A high angiopoietin-2/angiopoietin-1 ratio is associated with a high risk of septic shock in patients with febrile neutropenia[J].Crit Care, 2013,17(4):R169. |
| [19] | Wang K, Bhandari V, Giuliano JS, et al.Angiopoietin-1, Angiopoietin-2 and Bicarbonate as Diagnostic Biomarkers in Children with Severe Sepsis[J].PLoS One, 2014, 9(9):e108461. |
| [20] | Mammoto T, Jiang A, Jiang E, et al. Platelet-rich-plasma Extract Prevents Pulmonary Edema through Angiopoietin-Tie2 Signaling[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,52(1):56-64. |
| [21] | Huang YQ, Li JJ, Hu L, Lee M, Karpatkin S.Thrombin induces increased expression and secretion of angiopoietin-2 from human umbilical vein endothelial cells[J]. Blood, 2002, 99(5):1646-1650. |
| [22] | Ziegler T, Horstkotte J, Schwab C, et al. Angiopoietin 2 mediates microvascular and hemodynamic alterations in sepsis[J].J Clin Invest. 2013, 66549[Epub ahead of print]. |
| [23] | Bhandari V, Choo-Wing R,Harijith A,et al.Increased hyperoxia-induced lung injury in nitric oxide synthase 2 null mice is mediated via angiopoietin 2[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012, 46(5):668-676. |
| [24] | Stiehl T, Thamm K, Kaufmann J,et al. Lung-targeted RNA interference against angiopoietin-2 ameliorates multiple organ dysfunction and death insepsis[J].Crit Care Med, 2014, 42(10):e654-662. |
| [25] | Gores KM, Delsing AS, Kraus SJ,et al.Plasma angiopoietin 2 concentrations are related to impaired lung function and organ failure in a clinical cohort receiving high-dose interleukin 2 therapy[J].Shock, 2014, 42(2):115-120. |