中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (1): 43-45
蛋白酶激活受体-1阻断剂对兔心肺复苏后脑损伤的保护作用
杨敬宁,肖敏 ,王学军,梁鹏飞,柴林,罗明    
510080 广州,中山大学附属第一医院急诊科(崔喜梅、夏金明、胡春林、李欣、禹移、荆小莉);
10080 广州,中山大学附属第三医院肾内科(熊海霞);
10080 广州,杭州师范大学附属医院急诊科(夏金明)

心脏骤停后综合征(post-cardiac arrest syndrome,PCAS)是心肺复苏患者自主循环恢复后出现的多器官功能障碍综合征,病死率高、预后差,主要原因是心脏骤停后脑组织持续性损伤[1, 2]。心脏骤停心肺复苏的本质是全身缺血-再灌注损伤,脑组织对缺氧最敏感,因而最易损伤。心脏骤停后脑损伤虽然由缺血缺氧直接引起,其损伤机制包括兴奋性中毒、钙离子平衡失调、自由基损伤和细胞死亡信号通路活化[3] 。但是心脏骤停后脑缺血导致的间接损伤未引起足够重视。近来研究表明,脑缺血或出血时凝血酶可通过受体及非受体介导途径导致脑损伤,其重要途径之一是通过蛋白酶激活受体-1(protease- activated receptor 1,PAR-1)活化加重神经元损伤,其损伤与N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)有关。PAR-1激活可上调NMDA受体介导的兴奋性氨基酸毒性,从而导致细胞凋亡[4]。此外,凝血酶活化PAR-1,引起脑组织炎症反应,亦是脑损伤的重要原因。因此,阻断凝血酶激活PAR-1应该是防治脑损伤的有效途径。本研究应用兔心脏骤停后综合征模型,探索应用蛋白酶激活受体-1的特异性阻断剂对心肺复苏后脑损伤的影响。

1 材料与方法 1.1 实验动物与模型建立

本动物实验得到湖北医药学院动物实验伦理委员会的批准。日本大耳白兔30只(湖北省实验动物研究中心提供)6月龄,雄性,体质量(2.43±0.23)kg,随机(随机数字法)分为假手术组、心脏骤停后综合征(PCAS)组、PAR-1阻断剂组,每组10只。兔心脏骤停复苏后综合征(PCAS)制备方法依据文献[5]方法进行,简述如下。兔速眠新0.24 mL/kg麻醉后固定,用24号留置针穿刺股动脉,连接ZOLL全功能除颤监护起搏仪,进行心电监护。逆行气管插管,固定气管导管。心率、呼吸、血压稳定5 min后(以此作为实验计时点,即0时),采集动物血液,-80 ℃储藏供检测用。除假手术组外,其余各组耳缘静脉静注司可林1 mg/kg,1 min后夹闭气管导管至心搏骤停。心搏停止的标准: 动脉血压失去波动呈一条直线或平均动脉压<18 mmHg作为心搏骤停的判断标准(1 mmHg=0.133 kPa)。

心搏停止5 min后进行心肺复苏,呼吸机辅助呼吸 ,同时胸外心脏按压,频率180~220次/min;静注肾上腺素0.25 mg /kg,每3 min一次;5%的碳酸氢钠2 mL/kg,每30 min一次,共4次;陆醒灵0.24 mL/kg,肌注。复苏成功的标准:心肺复苏持续10 min,动物恢复自主循环(ROSC)持续10 min以上为复苏成功,否则为复苏失败。复苏成功动物脱机拔管,保持气道通畅。

1.2 动物处理

PAR-1阻断剂组于复苏成功后15 min,以PAR-1阻断剂耳缘静脉注射SCH79797 (25 μg/kg i.v.,Santa Cruz 公司,美国),每日1次,共3次。假手术组、PCAS组分别以等量生理盐水静脉注射。分别在72 h处死兔,摘除脑海马组织,迅速置-80 ℃备用。

1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清NSE含量

兔于心搏骤停前及复苏后24、48、72 h不同时间点采取股静脉血,检测血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平(试剂盒购自美国RD公司,操作按试剂盒说明书进行),以监测脑损伤情况。

1.4 病理观察

取海马组织,制备石蜡切片,常规苏木精-伊红(HE)染色法染色,显微镜下观察。

1.5 原位末端标记法(TUNEL)分析脑细胞凋亡情况

石蜡切片常规脱蜡至水,用蛋白酶K工作液孵育15 min,滴加破膜工作液10 min,洗涤,取TUNEL试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1∶ 9混合,覆盖组织,37 ℃孵育60 min。切片洗涤3次,甩干后滴加DAPI染液,避光室温孵育10 min。洗涤后,用抗荧光淬灭封片剂封片,于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。同一视野下应用Image-Pro Plus 6.0软件对每张图像进行分析,凋亡的细胞(绿色荧光)占总细胞个数(蓝色荧光)比即为该视野组织细胞凋亡率。

1.6 Western blot分析海马组织caspase-3蛋白水平

在72 h时点处死兔,摘除海马组织,常规方法提取蛋白、8%SDS-PAGE电泳、转膜和封闭。分别加入1∶ 500的一抗鼠抗兔caspase-3单克隆抗体和1∶ 1000的鼠抗兔β-肌动蛋白(actin,内参)单克隆抗体(均为Santa Cruz产品),4 ℃孵化过夜,用Western洗涤液洗涤3次。用1∶ 3000的二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG)室温孵育30 min,用TBST洗涤。用增强的化学发光试剂盒进行显影、定影。曝光的X线片进行扫描,采用AlphaEase FC软件处理系统分析目标带的吸光度值。

1.7 统计学方法

计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 16.0统计软件处理数据。两组数据符合正态分布,三组间采用方差分析,多组间不同时间点测量资料采用重复测定方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 心肺复苏情况

心搏骤停5 min复苏成功18只,失败2只;复苏后24~72 h死亡2只。

2.2 PAR-1阻断剂对NSE的影响

PAR-1阻断剂SCH79797显著降低NSE,与PCAS组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),说明SCH79797能明显改善肝脑功能障碍(表 1)。

表 1 PAR-1阻断剂对血清NSE的影响(μg/L,n=8)
组别 0 24 h 48 h 72 h
Sham组 3.61±0.54 3.63±0.49 3.60±0.51 3.61±0.52
PCAS组 3.58±0.69 12.58±2.13 a 10.76±3.34 a 7.98±1.15 a
PAR-1阻断剂组 3.59±0.65 9.33±3.16 b 7.35±1.36 b 5.16±0.72 b
注:与sham组比较,aP< 0.01;与PCAS组比较,bP<0.05
2.3 海马组织HE染色分析

PCAS组均可见脑组织出现细胞肿胀,胞浆嗜酸性变,胞核碎裂、溶解、固缩,淋巴细胞和中性粒细胞浸润(图 1B)。PAR-1阻断剂组脑组织上述变化较轻(图 1C)。假手术组未见异常变化(图 1A)。

A:sham组;B:PCAS组;C:PAR-1阻断剂组 图 1 海马组织HE染色结果(×400)
2.4 脑细胞凋亡情况的分析

TUNEL分析结果表明,假手术组仅有极少量细胞凋亡,凋亡百分率为(2.40±0.84)%,而PCAS组神经元细胞凋亡则显著增多,凋亡百分率为(31.35±6.11)%,差异有统计学意义(P<0.01)。PAR-1阻断剂组神经元细胞凋亡较PCAS组明显减少,凋亡百分率为(8.58±3.20)%,差异有统计学意义(P<0.01),提示PAR-1阻断剂对心脏骤停后缺血-再灌注后的神经元凋亡具有抑制作用(图 2)。

A:sham组;B:PCAS组;C:PAR-1阻断剂组 图 2 脑海马细胞凋亡石蜡切片荧光TUNEL分析 (FITC×200)
2.5 PAR-1阻断剂对脑组织caspase-3活性的影响

免疫印迹结果(图 3A)表明,心脏骤停后脑缺血casepase3前体(pro-casepase3)无明显改变,但导致caspase-3活性(cleaved casepase-3/actin)显著升高,假手术组caspase-3活性为(0.02±0.01),PCAS组caspase-3活性为(0.21±0.04)。与假手术组比较,PCAS组脑海马caspase-3活性增高,差异有统计学意义(P<0.01,图 3B)。PAR-1阻断剂组则显著降低至(0.04±0.02),caspase-3活性较PCAS组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01,图 3B),表明PAR-1阻断剂对缺血引起的caspase-3活化及其活性升高具有抑制作用。

A:Western blot检测casepase 3 表达;B:cleaved casepase 3 水平的半定量分析;1:sham组;2:PCAS组;3:PAR-1阻断剂组; 与sham组比较,aP< 0.01;与PCAS组比较,bP< 0.01 图 3 兔脑海马组织casepase 3活性的变化
3 讨论

心脏骤停后的脑损害是死亡的常见原因,尤其是院前心脏骤停送医患者,高达68%最终死于脑损伤[6]。已经发现缺血后神经元出现细胞内Ca2+ 超载、自由基损伤、兴奋性氨基酸的过度释放引起神经元的过激反应[7],以及细胞死亡信号通路的激活[8],均参与脑损伤。近来研究表明,凝血酶亦是诱发脑损伤的重要因素,脑缺血或出血时凝血酶可通过多个途径导致脑损伤。心脏骤停后凝血系统常被激活,凝血酶活性升高[9, 10, 11],凝血酶主要通过激活PAR-1途径参与脑损伤的发生[12, 13, 14]

蛋白酶激活受体(protease-activated receptors,PARs)属于G蛋白偶联受体超家族,现已知有4种PARs,分别为PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4,其中PAR-1、PAR-3和PAR-4由凝血酶激活。脑内神经元主要表达PAR-1,此外,星形胶质细胞和小胶质细胞也广泛表达PAR-1。有研究[4, 13] 发现,PAR-1激活可上调NMDA受体介导的兴奋性氨基酸毒性,从而导致神经元细胞凋亡。脑内小胶质细胞是潜在的炎性巨噬细胞,凝血酶可通过PAR-1激活小胶质细胞,表达和释放促炎因子,如TNF-α、IL-6和趋化因子,引起脑组织继发性炎症反应,导致继发性灌注不良或自由基生成,使脑细胞凋亡或坏死,导致脑组织损伤[15, 16] 。因此,通过抑制PAR-1通路理论上可减轻心脏骤停后凝血酶激活PAR-1引起的神经元损伤。

本研究利用PAR-1阻断剂SCH79797干预兔 PCAS模型,结果发现SCH79797能明显降低PCAS兔血清神经元特异性烯醇化酶(NSE),而NSE是反映神经元早期损伤特异的指标。海马组织HE染色分析表明,PCAS发生72 h脑组织仍然出现细胞肿胀,胞浆嗜酸性变,胞核碎裂、溶解,炎性细胞浸润,而PAR-1阻断剂组脑细胞变性、坏死及炎性细胞浸润明显减轻。由此可见,PAR-1阻断剂SCH79797能明显减轻心肺复苏后神经元损伤。

本研究发现,心脏骤停心肺复苏后72 h脑海马细胞存在较高的凋亡率,说明心脏骤停心肺复苏后脑损伤持续存在较长时间,其发生机制可能与缺血-再灌注损伤密切相关。关于缺血-再灌注损伤的发生机制,主要包括无复流现象、钙超载、白细胞的浸润、能量代谢障碍及自由基损伤。应用PAR-1阻断剂SCH79797治疗后,则可见脑细胞凋亡减少。免疫印迹分析发现,凋亡相关效应蛋白cleaved-casepase3在假手术组活性较低,而在 PCAS组则cleaved-casepase3活性增强,说明心脏骤停全脑缺血后凋亡相关蛋白被异常激活,这与国外Namura等[17]的研究结果一致。应用PAR-1阻断剂SCH79797治疗后,cleaved-casepase3表达显著低于PCAS组,进一步确认应用PAR-1阻断剂SCH79797可抑制心肺复苏后脑细胞凋亡。至于PAR-1激活引起脑损伤的信号机制,研究表明可能与活化有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路有关[12]

总之,本研究发现PAR-1阻断剂SCH79797可减轻心肺复苏后脑组织炎症反应,并降低脑细胞凋亡,减轻心脏骤停后脑缺血缺氧引起的神经元损伤,发挥神经保护作用。值得提出的是,凝血酶作用的信号通路有多条,包括受体途径和非受体途径,SCH79797只能阻断PAR-1受体途径发挥拮抗作用,因此SCH79797作用有其局限性。至于SCH79797阻断PAR-1后,神经元细胞内信号通路如何发生变化则是进一步探索的方向。

参考文献
[1] Cart BG,Kahn JM,Merchant RM,et a1.Inter-hospital variability in post-cardiac arrest mortality[J].Resuscitation,2009,80(1):30-34.
[2] Snyder-Ramos SA,Bottiger BW. Molecular markers of brain damage--clinical and ethical implications with particular focus on cardiac arrest[J].Restor Neurol Neurosci, 2003,21(3/4):123-139.
[3] Nishizawa Y. Glutamate release and neuronal damage in ischemia[J] . Life Sci,2001,69(4):369-381.
[4] Han KS, Mannaioni G, Hamill CE,et al.Activation of protease activated receptor 1 increases the exciability of the dentate granule neurons of hippocampus[J].Mol Brian,2011,4:32-43.
[5] 肖敏,吕军,刘菊英,等.心脏骤停后综合征动物模型的建立[J].中国急救医学, 2010, 30 (6) : 532-536.
[6] Laver S, Farrow C, Turner D, et al.Mode of death after admission to an intensive care unit following cardiac arrest[J] .Intensive Care Med, 2004,30(11):2126-2128.
[7] Dohmen C, Kumura E, Rosner G,et al.Extracellular correlates of glutamate toxicity in short-term cerebral ischemia and reperfusion: a direct in vivo comparison between white and gray matter[J] .Brain Res,2005 ,1037(1/2):43-51.
[8] Charriaut-Marlangue C, Margaill I, Represa A,et al.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia: an in situ DNA fragmentation analysis[J]. J Cereb Blood Flow Metab,1996 ,16(2):186-194.
[9] Bottiger BW, Motsch J, Bohrer H, et al. Activation of blood coagulation after cardiac arrest is not balanced adequately by activation of endogenous fibrinolysis[J]. Circulation,1995,92(9):2572-2578.
[10] Gando S, Nanzaki S, Morimoto Y, et al.Tissue factor and tissue factor pathway inhibitor levels during and after cardiopulmonary resuscitation [J].Thrombosis Research,1999,96(2):107-113.
[11] Johansson J, Ridefelt P, Basu S,et al.Antithrombin reduction after experimental cardiopulmonary resuscitation[J].Resuscitation,2003,59(2):235-242.
[12] Wang J,Jin H,Hua Y,et al. Role of protease activated receptor-1 in brain injury after experimental global cerebral ischemia [J].Stroke,2012,43(9):2476-2482.
[13] Hamill CE, Mannaioni G, Lyuboslavsky P,et al.Protease-activated receptor 1-dependent neuronal damage involves NMDA receptor function[J].Exp Neurol,2009,217(1):136-146.
[14] 刘飞飞,柳夫义,王林,等.蛋白酶激活受体-1在凝血酶诱导大鼠脑损伤及神经再生中的作用[J].浙江大学学报(医学版),2013,42(3):283-290.
[15] Mller T, Hanisch UK, Ransom BR.Thrombin-induced activation of cultured rodent microglia[J].J Neurochem,2000,75(4):1539-1547.
[16] 刘郁,张海鹏.缺血缺氧性脑损伤病理机制[J].中华急诊医学杂志, 2003,12(7):496-497.
[17] Namura S, Zhu J, Fink K, et al. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia[J]. J Neurosci, 1998, 18(10): 3659-3668.