急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是脓毒症患者常见的并发症之一^[1]。约40%~60%的脓毒症患者将合并AKI，约60%以上的患者将发展为多脏器功能不全，病死率高达50%以上^[2]。导致脓毒症AKI（septic AKI，SAKI）病死率高的主要因素是其发病原因不明，并且发病机制复杂，至今无统一有效治疗方案^[3]。因此，深入探讨SAKI的发病机制，发现导致患者病情加重的关键因素，早期预防和干预是其诊治的重要策略。小泛素样修饰蛋白特异性肽酶2（small ubiquitin-related moditier protein specific peptidase 2，SENP2）是人体重要的泛素样修饰因子，其存在于人体的肾脏、大脑、肝脏等组织内，在人体组织细胞间传递中起着关键作用^[4]。然而，SENP2在SAKI发病过程中的作用机制仍不清楚。本研究拟使用SENP2基因敲除小鼠，构建脓毒症模型，研究SENP2调控NLRP3炎症小体活化在SAKI的作用及机制，为患者的早期临床诊治提供新思路和新方向。

8-12周龄SPF级SENP2基因敲除C57BL/6小鼠20只购自中国赛业生物公司；ELISA试剂盒购自中国上海Sigma公司；兔抗SENP2蛋白抗体购自中国上海Abcam生物公司；兔多克隆NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）抗体、IL-1β抗体、Caspase-1一抗、ASC一抗和GAPDH均购自中国武汉伊莱瑞特生物科技公司；电泳试剂购自中国南京建成生物；蛋白提取试剂盒购自中国上海Abcam生物公司。

SPF级野生型C57BL/6小鼠20只，8~12周龄，体重16~24 g，性别不限，购自中国浙江大学动物实验中心[营业证号：SYXK（浙）2018-0016]。所有小鼠均饲养于宁波大学实验动物中心，并饲养于22~25℃室温和昼夜均12 h的环境下，饲养期间不限饮水和进食，适应喂养1~2周后实验。实验前6 h禁食和禁水。小鼠被分为4组，即野生型假手术组（wild type-Sham，WT-Sham）、野生型盲肠结扎和穿孔术组（wild type cecal ligation and perforation，WT-CLP）、SENP2基因敲除假手术组（SENP2 gene knockout sham，KO-Sham）和SENP2基因敲除盲肠结扎和穿孔术组（SENP2 gene knockout cecal ligation and perforation，KO-CLP），每组各10只小鼠。

使用CLP法构建脓毒症模型。具体步骤为：戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，腹中线做1~2 cm切口，进腹后找出盲肠，脱出腹腔后针头刺穿盲肠2次，0号缝线结扎盲肠近端，回纳后关腹，放回笼中继续饲养。当CLP术后小鼠出现精神萎靡或嗜睡、发热、少食、蜷缩、心率和呼吸频率增快等症状时，即脓毒症造模成功。当小鼠存活时间未达到预设实验终点时，尸体将做无公害处理，并另选小鼠使用相同方案重新造模进行补救。WT-Sham组和KO-Sham组小鼠仅做开关腹，不做盲肠穿孔和结扎。CLP术后24 h处死小鼠，收集血标本，6 000~8 000 r/min离心15 min，取上清液，-80℃低温冰箱存储。取小鼠肾脏，4%多聚甲醛固定右肾，用于后续的病理和免疫组织化学实验，左肾置于液氮中速冻后移入-80℃低温冰箱存储，用于后续实验。根据《全球改善肾脏病预后组织指南》标准诊断AKI，并验证CLP是否成功诱发AKI^[5]。本实验所有操作均严格遵照《国际动物实验指南》，并获得宁波大学动物实验伦理委员会的批准。

采用4%多聚甲醛中固定肾组织24~48 h，按照常规PBS清洗，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红(HE)染色，封片。随机选取3个视野，普通光镜观察肾损伤并评分。肾损伤半定量评分方法：按照以往经验，无损伤计0分；损伤面积 < 25%计1分；损伤面积25%~50%计2分，损伤面积50%~75%计3分；损伤面积 > 75%计4分^[6]。

采用ELISA法测定小鼠血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血浆中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白（plasma neutrophil gelatinase associated lipocalin, pNGAL）和血浆肾损伤分子1（plasma kidney injury molecule 1, pKIM-1）水平，绘制标准曲线并定量指标。

采用ELISA法测定小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10水平，绘制标准曲线和定量。

取肾组织石蜡包块，切片，按常规PBS洗涤，乙醇脱水，甲二苯透明，滴加一抗单克隆SENP2蛋白抗体（1:800），常温过夜孵育，PBS洗涤，滴加二抗，孵育，封片。阴性对照随机选用PBS（0.01M）作为一抗染色。每张切片随选3个视野，普通光镜下观察。

取新鲜肾组织，提取总蛋白，BCA鉴定浓度，分离蛋白，转移至二氟乙烯，5%脱脂奶粉封闭，加入兔多克隆NLRP3一抗（1:800）或IL-1β（1:500）或Caspase-1（1:600）或ACS（1:800）或GAPDH（1:500），常温下过夜，孵育。加入二抗（1:1 000），室温下孵育6 h，添加ECL显色。使用Gel Doc 2000成像系统观察条带，半定量测定浓度。

使用SPSS 23.0软件进行统计分析，将符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表达，多组间比较采用单因素方差分析One-way ANOVA进行，多组间的两两组数据的比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

在本实验中，使用CLP法建立脓毒症小鼠模型的成功率高达85.00%，WT-Sham组和KO-Sham组在预设实验终点内无小鼠死亡。WT-CLP组和KO-CLP组在CLP术后12 h内小鼠存活率高达100%，而在CLP术后24 h内WT-CLP组和KO-CLP组分别有2只（20.00%）和1只（10.00%）小鼠死亡。如图 1.所示，在WT-Sham组小鼠肾组织中可见少量SENP2蛋白表达，而在WT-CLP组小鼠肾组织中SENP2蛋白表达主要集中在肾小管上皮组织内。在SENP2 KO小鼠Sham组和CLP组均未见SENP2蛋白表达。与WT-Sham组比较，WT-CLP组小鼠肾组织中SENP2蛋白表达显著升高（P < 0.01）。

注：WT-Sham为野生型对照组；WT-CLP为野生型盲肠结扎和穿孔组；KO-Sham组为SENP2敲除对照组；KO-CLP组为SENP2敲除盲肠结扎和穿孔组；与WT-Sham组比较，P < 0.001 图 1 SENP2基因敲除小鼠肾组织中无SENP2蛋白表达（IHC，×200） Fig 1 No expression of SENP2 protein in renal tissue of SENP2 gene knockout mice (IHC, × 200)

图选项

WT-Sham组小鼠肾小管和肾小球结构规整，肾小球包膜完整，间质未见炎症细胞；WT-CLP组小鼠肾小管和肾小球结构紊乱，肾小管上皮细胞脱落，肾小球包膜完全破裂，间质充满大量炎症细胞。SENP2 KO-Sham组小鼠肾小管和肾小球结构规整，肾小球包膜完整，间质无炎症细胞浸润；SENP2 KO-CLP组小鼠肾小管和肾小球结构较为规整，可见少量肾小管上皮细胞脱落，肾小球包膜部分破裂，间质少量炎症细胞浸润。使用半定量分析，WT-CLP组小鼠肾组织损伤评分显著高于WT-Sham组（P < 0.01），同时SENP2 KO-CLP组小鼠肾组织损伤评分也显著高于KO-Sham组（P < 0.01）。进一步与WT-CLP组小鼠比较，KO-CLP组小鼠肾组织损伤评分明显降低（P < 0.01）。见图 2。

注：WT-Sham为野生型对照组；WT-CLP为野生型盲肠结扎和穿孔组；KO-Sham组为SENP2敲除对照组；KO-CLP组为SENP2敲除盲肠结扎和穿孔组；与WT-Sham组比较，P < 0.001；与KO-Sham组比较，P < 0.001；与WT-CLP组比较，P < 0.01 图 2 SENP2基因敲除小鼠肾组织病理损伤减轻（HE，×400） Fig 2 Knockout of SENP2 gene reduces renal tissue pathological damage in mice (HE, ×400)

图选项

4组小鼠肾功能指标SCr、BUN、pNGAL和pKIM-1表达水平比较，差异有统计学意义（P均 < 0.01）。与WT-Sham组小鼠比较，WT-CLP组SCr、BUN、pNGAL和pKIM-1表达水平均显著升高（P均 < 0.001）。与KO-Sham组小鼠比较，KO-CLP组SCr、BUN、pNGAL和pKIM-1表达水平同样均显著升高（P均 < 0.001）。进一步与WT-CLP小鼠比较，KO-CLP组SCr、BUN、pNGAL和pKIM-1表达水平均明显降低（P均 < 0.01）。见表 1。

4组小鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10水平比较，差异有统计学意义（P < 0.001）。与WT-Sham组小鼠比较，WT-CLP组小鼠血浆中TNF-α和IL-1β的水平均明显升高（P均 < 0.001），而IL-4和IL-10的水平均明显降低（P均 < 0.001）。与KO-Sham组小鼠比较，KO-CLP组小鼠血浆中TNF-α和IL-1β的水平也均明显升高（P均 < 0.001），而IL-4和IL-10的表达水平也均明显降低（P均 < 0.001）。进一步与WT-CLP小鼠比较，KO-CLP组小鼠TNF-α和IL-1β水平均明显降低（P均 < 0.05），而IL-4和IL-10的表达水平均有所升高，但差异无统计学意义（P均 > 0.05）。见表 2。

小鼠肾组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白水平比较，差异有统计学意义（P均 < 0.001）。与WT-Sham组小鼠比较，WT-CLP组小鼠NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白水平均显著升高（P均 < 0.001）。与KO-Sham组小鼠比较，KO-CLP组小鼠NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白水平也均显著升高（P均 < 0.001）。此外，与WT-CLP组小鼠比较，KO-CLP组小鼠NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白水平均显著降低（P均 < 0.05）。见表 3，图 3。

注：WT为野生型；KO为SENP2基因敲除型；Sham为假手术组；CLP为盲肠结扎和穿孔组；GAPDH.甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Western-blotting法） 图 3 各组小鼠肾组织NLRP3通路蛋白表达 Fig 3 Expression of NLRP3 pathway protein in kidney tissue of mice in each group

图选项

脓毒症常常起病急、进展快，可迅速发展为多器官功能损伤，严重影响着全人类的生命健康^[6-7]。在脓毒症的发病过程中，AKI是其常见的合并症之一，如不能及时发现和救治，可迅速进展为急性肾功能衰竭^[8]。因此，深入探究SAKI的发病机制是防治的关键，具有非常重要的临床意义。最新研究发现，小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-related moditier protein，SUMO）是一种新发现的类泛素蛋白质，其主要通过与底物相结合调控相关蛋白活性^[9-11]。SUMO家族属于高度保守蛋白，主要受SENP蛋白酶家族调控，而SENP2是人体重要的泛素样修饰因子，存在于人体的肾脏、大脑、肝脏等组织中，在人体组织细胞间传递中起着关键作用^[12-13]。

为了探讨SENP2在SAKI发病机制中的作用，本研究利用SENP2基因敲除小鼠，并构建了SAKI小鼠模型。笔者前期的研究结果表明，肾脏作为脓毒症期间最常受损的靶器官，在疾病早期即可突显出来^[14-16]。本研究发现在CLP后的24 h脓毒症小鼠即出现AKI，并且在肾组织中SENP2蛋白表达明显升高，伴随着肾组织病理损伤加重和肾功能的显著降低。然而，SENP2基因敲除后，虽然脓毒症小鼠的肾脏病理损伤和肾功能均有不同程度的降低，但与野生型脓毒症小鼠相比较，肾病理损伤和肾功能均有所减轻。由此可见，SENP2在SAKI发病过程中起着重要作用，通过某种手段降低SENP2基因表达将对AKI有显著的保护作用。

众所周知，炎症反应是脓毒症过程的核心，而炎症因子活性决定了疾病进展的速度和治疗的最终结局^[17-18]。为了确定SENP2基因是否对脓毒症期间炎症因子活性产生影响，进行了深入研究。结果表明，在脓毒症早期促炎因子TNF-α和IL-1β水平均显著升高，而抗炎因子IL-4和IL-10水平均明显降低。在SENP2基因敲除情况下，CLP小鼠血浆TNF-α和IL-1β水平均显著降低，但抗炎因子IL-4和IL-10水平的升高却不显著。因此，SENP2基因的表达水平部分决定着炎症因子活性，然而具体调控机制仍不清楚。

NLRP3基因缺失可改善脓毒症诱发的肾功能不全和肾组织病理损害，具体机制与抑制炎症反应和抗细胞焦亡等密切相关。为了明确SENP2调控SAKI过程中的炎症反应是否与NLRP3信号通路相关，本研究进行了深入的研究。结果表明，CLP导致脓毒症小鼠肾组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白水平的显著升高，而SENP2基因敲除后小鼠肾组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白表达水平均显著降低。因此，笔者推断NLRP3信号通路可能是脓毒症期间引发过度炎症反应的关键环节，SENP2通过调控NLRP3信号通路在SAKI过程中起着重要作用。深入研究干预SENP2是否有效抑制NLRP3信号通路从而改善SAKI将是未来研究的重点。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  樊恒：动物实验、数据收集和整理、论文撰写；樊恒、孙敏和朱建华：工作支持、研究设计；朱建华：统计学分析指导和论文修改