脓毒症(sepsis)一直以来都是重症医学医师面临的重大挑战，其发病率和病死率在全球范围内持续处于较高水平^[1]。脓毒症心肌病(septic cardiomyopathy, SC)是脓毒症休克的常见并发症之一，与其不良预后直接相关。SC的病理生理学机制尚不完全明确，所涉及通路机制十分复杂^[2–5]：包括循环心肌抑制物质的释放、肾上腺素能通路的下调、一氧化氮和活性氧的释放、钙处理异常、线粒体功能障碍、冠状动脉微血管扰动、细胞凋亡、编码肌节线粒体蛋白的基因下调等。

血管生成素样蛋白家族(angiopoietin-like proteins，ANGPTLs)是一类新发现的血管相关蛋白调节因子，ANGPTL4是此家族中的一种蛋白因子，过去的研究主要聚焦在其脂质代谢、血糖调节、血管再生等方面^[6]。然而，近年来一些实验结论表明，在一些感染及炎症模型中，ANGPTL4基因显著上调，促进炎症进展，加重了组织损伤^[7-8]。但目前有关ANGPTL4在LPS诱导的脓毒症心肌损伤中的确切作用尚不明确。本研究应用脓毒症小鼠心肌组织及细胞模型，明确ANGPTL4在LPS诱导的脓毒症心肌组织以及心肌细胞中的表达情况，并尝试探究ANGPTL4在脓毒症心肌损伤中的作用机制。

将50只C57BL/6小鼠(8周龄)随机（随机数字法）分为脂多糖(LPS)治疗组和对照组(每组n=25)。治疗组小鼠腹腔内注射细菌LPS(10 mg/kg) (L3012, Sigma-Aldrich, USA)以建立脓毒症小鼠模型。对照组接受等体积的0.9%生理盐水溶液。注射后24 h，收取造模成功小鼠的左心室组织，并将其混合到一个处理(TRE)样品中，将健康小鼠的左心室组织混合到一个对照(CON)样品中。制备TRE和CON样品用于RNA测序(RNA-seq)。本研究经天津医科大学动物伦理与福利委员会批准，审查编号TMUaMEC 2023002。

不同组的左心室组织样本送至广州锐博生物技术有限公司(GuangZhou, China)进行转录组测序。测序程序由Ribo Bio在具有对端150 bp的Illumina测序平台(Illumina, USA)上进行，对于RNA-Seq，使用Magzol试剂(Magen, China)提取总RNA。使用Illumina HiSeq仪器进行文库测序，具有150 bp的配对末端读数。对原始数据进行了预处理使用Trimmomatic，一种常用的软件用于高通量测序数据分析，包括读取数字统计的质量控制和生成。映射的读数是使用袖扣组装的，并且不完全组装的转录本由参考基因注释。

用1 mL Trizol试剂(Invitrogen, USA)处理小鼠的左心室组织或者心室肌细胞并裂解30 min。提取的RNA样品溶解在无菌水中。采用NanoDrop ND-2000仪器检测RNA纯度，OD260/OD280值在1.8 ~ 2.1之间，说明RNA纯度足够。使用FastQuant RT Kit (with gD-Nase) (KR106, Tiangen, China)将RNA反转录为cDNA。cDNA产物使用SYBR Premix E-x Taq Ⅱ试剂盒(Takara, Japan)在Applied BiosystemsTM 7500 Fast Dx Real-Time PCR (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)上作为PCR模板。ANGPTL4的引物序列为Forward：CAGCTCATTGGCTTGACTCCC; Reverse: CAGGCGTCTCTGAATCACTGTC。GAPDH的引物序列为Forward：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA；Reverse：TTGCTGTTGAAGTCGCA-GGAG。以GAPDH为内参计算ANGPTL4的相对表达量。

使用RIPA裂解缓冲液从小鼠的左心室组织或者心室肌细胞中分离出总蛋白，用BCA试剂盒测定总蛋白的浓度。随后，将蛋白样品置于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中进行分离，之后转移到PVDF膜上，并用5%脱脂奶粉在室温中封闭30 min。TBST清洗后，4℃一抗[Rabbit anti-Bax (ab104156)，浓度1:1 000；Mouse anti-Bcl2 (ab692)，浓度1:1 000；Rabbit anti-Caspase3 (ab13874)，浓度1:500；Mouse anti-β-actin (ab8226)，浓度1:5000]孵育过夜，然后在室温下二抗[Goat anti-rabbit IgG-HRP (ab7090), Goat anti-mouse IgG-HRP (ab97040)]孵育1 h。洗涤后，蛋白条带使用电化学发光(ECL)试剂盒进行可视化测定，并使用Image Pro软件进行定量。

取小鼠乳鼠的左心室组织，切成1 mm×1 mm×1 mm小块。用0.25% Trypsin-EDTA，37℃水浴消化，并分散细胞。当观察不到明显组织时，加入含有10% FBS的DMEM培养基，停止消化。100 μm滤网过滤细胞悬液，300 r/min离心5 min，抽吸上清液。加入红细胞溶解液，去除红细胞。孵育3~5 min后，300 r/min，离心5 min，抽吸上清液。采用梯度沉降法分离原代心肌细胞，之后将心肌细胞置于含有10% FBS的DMEM培养皿中，37℃，5% CO₂，培养90 min，去除附着的杂质，收获主要含有心肌细胞的细胞悬液，然后将心肌细胞置于细胞培养箱中进行培养。

细胞接种于6孔板，密度为2 × 10⁶个/孔，每孔加入1 mL基本培养基(不含青霉素-链霉素和血清)。当细胞生长到约80%的浓度时，每孔加入200 pmol siRNA或4 µg pcDNA3.1⁺质粒和10 µl lipofectamineTM3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。将六孔板置于细胞培养箱中，37℃下培养6~8 h，然后更换完全培养基。转染24 h后，收集细胞进行后续检测。

以5×10³个/孔的密度取对数生长期的小鼠乳鼠心室肌细胞接种于96孔板。细胞贴附后，使用不同浓度的LPS进行处理，同时加入药物，随后在37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h。去除培养基，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续孵育30 min，最终在450 nm处测量吸光度以确定细胞活力。

使用胰蛋白酶消化心肌细胞，在3 000 r/min下离心10 min，弃上清液。加入预冷的PBS，再在3 000 r/min下离心10 min，弃上清液。然后将Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD Sciences, Franklin Lake, NJ, USA)中的结合缓冲液重悬细胞，之后加入Annexin V-FITC和PI染料，并在4℃避光孵育15 min。1 h内用流式细胞仪(BD FACSverse, BD Sciences, Franklin Lake, USA)检测细胞凋亡情况。

所有数据均采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(LSD-t检验)。以P < 0.05为差异有统计学意义。

建立了脓毒症小鼠模型：腹腔注射LPS后，小鼠出现脓毒症症状，如寒战、无精打采、毛发竖立和腹泻；腹腔注射LPS 24 h后，分别收取两组小鼠的左心室，做了RNA-seq。结果显示，与对照组小鼠相比，脓毒症心肌病小鼠心室组织中ANGPTL4的表达明显上调(图 1A和1B)。收集了两组小鼠的心室组织，并且分离了小鼠乳鼠的心室肌细胞，用LPS刺激24 h，qRT-PCR和western blot的结果发现，与对照相比，脓毒症小鼠的动物模型及细胞模型中，ANGPTL4的mRNA和蛋白水平均显著增加(图 1C~F)。

注：A: RNA-Seq分析的对照组和脓毒症组小鼠心室组织中差异表达基因的热图；B: 对照组和脓毒症组心室组织中显著差异基因的火山图(红色图代表上调表达的基因，蓝色表示下调的基因)；C-D: qRT-PCR验证动物模型和细胞模型中ANGPTL4的mRNA表达情况；E-F: Western blot验证动物模型和细胞模型中ANGPTL4的蛋白表达情况; aP < 0.05 图 1 脓毒症小鼠心肌组织和心室肌细胞中ANGPTL4的表达情况 Fig 1 The expression of ANGPTL4 in myocardial tissue and ventricular cardiomyocytes of sepsis mice.

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为了阐明ANGPTL4在脓毒症心肌损伤过程中发挥的作用，在小鼠乳鼠的心室肌细胞中构建了ANGPTL4的沉默和过表达载体，并通过qRT-PCR以及Western blot进行验证。结果显示心室肌细胞中转染ANGPTL4的siRNA之后，与NC相比，si-ANGPTL4组的ANGPTL4的mRNA及蛋白的表达量显著下降(图 2A和C)；与之相反，将ANGPTL4-pcDNA3.1+质粒转染到心室肌细胞中中显著上调了ANGPTL4的水平(图 2B和D)。

注：A: qRT-PCR验证转染ANGPTL4的siRNA后心室肌细胞中ANGPTL4的mRNA表达情况；B: qRT-PCR验证转染ANGPTL4的过表达质粒后心室肌细胞中ANGPTL4的mRNA表达情况；C: Western blot验证转染ANGPTL4的siRNA后心室肌细胞中ANGPTL4的蛋白表达情况；D: Western blot验证转染ANGPTL4的过表达质粒后心室肌细胞中ANGPTL4的蛋白表达情况；aP＜0.05 图 2 构建ANGPTL4的沉默和过表达载体 Fig 2 Construction of silencing and overexpression vectors of ANGPTL4.

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为了确定ANGPTL4对心室肌细胞增殖的影响，转染了ANGPTL4的沉默和过表达载体，用CCK8法测定心室肌细胞的增殖情况。结果显示，与对照组相比，si-ANGPTL4转染后心室肌细胞的增殖能力显著增强，ANGPTL4过表达的心室肌细胞增殖能力明显减弱(图 3A-3B)。CCK8的结果表明，ANGPTL4抑制了心室肌细胞的活性。

注：A: CCK8法检测转染ANGPTL4的siRNA后心室肌细胞的增殖情况；B: CCK8法检测转染ANGPTL4的过表达质粒后心室肌细胞的增殖情况；C: Western blot验证转染ANGPTL4的siRNA后心室肌细胞中凋亡因子的表达；D: Western blot验证转染ANGPTL4的过表达质粒后心室肌细胞中凋亡因子的表达；aP＜0.05 图 3 ANGPTL4对心室肌细胞活力和凋亡的影响 Fig 3 The effect of ANGPTL4 on the viability and apoptosis of ventricular cardiomyocytes.

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心肌细胞的凋亡在SC中广泛存在，为了探究ANGPTL4对心室肌细胞凋亡的影响，转染了ANGPTL4的siRNA和过表达质粒，利用Western blot检测心室肌细胞中凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase 3的表达。结果显示，与对照组相比，转染si-ANGPTL4后心肌细胞中Bax和Caspase3的表达明显下调，Bcl-2的表达则明显上调(图 3C)。而转染pc-ANGPTL4后，Bax、Caspase3以及Bcl-2的表达呈相反趋势(图 3D)。

在心室肌细胞中转染了ANGPTL4的siRNA和过表达质粒，使用Annexin V/PI对心室肌细胞进行染色，流式细胞术检测心室肌细胞的凋亡。与对照组相比，si-ANGPTL4在Q2和Q3区域减少了凋亡细胞的数量；与之相反的是，ANGPTL4的过表达促使心室肌细胞凋亡的数量显著增加(图 4A-4B)。以上这些结果表明，ANGPTL4促进心室肌细胞的凋亡。

注：A: 流式细胞术检测心室肌细胞凋亡的代表性图片；B: 各组凋亡细胞的定量分析；aP＜0.05 图 4 流式细胞术检测ANGPTL4对心室肌细胞凋亡的影响 Fig 4 Flow cytometry to detect the effect of ANGPTL4 on the apoptosis of ventricular cardiomyocytes

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SC是一种严重但可逆转的心肌损伤，这种疾病的诊断尚无明确的定义^[9]，随着被人们的日渐熟知，关于其发病机制出现了越来越多的争论。已有研究证实晚期免疫抑制是脓毒症患者死亡的主要原因^[10]，然而许多研究表明，细胞因子过度激活和SC也是脓毒症患者的重要死亡原因^[11]。寻找抑制细胞因子的关键靶点，可以明显降低脓毒症患者的病死率，并改善患者预后。本研究结果表明，ANGPTL4在LPS诱导的脓毒症心肌损伤小鼠的心室组织和心肌细胞中均表达上调，并且ANGPTL4促进了心肌细胞的凋亡、降低了心肌细胞活力。所以探寻SC的发病机制，寻找潜在的治疗靶点是目前需要持续探索的。

ANGPTL4属于血管生成素样家族，在脂质代谢、血糖调节、血管再生、炎症反应等过程中均发挥重要作用。人类ANGPTL4的基因位于19号染色体，其氨基酸序列与小鼠的相似程度高达77%，因此，小鼠可以作为理想的动物模型来研究ANGPTL4的作用机制^[12]。研究表明ANGPTL4能够调节脂糖代谢和炎症信号，并且可以通过环境或者组织依赖模式发挥促炎和抗炎作用。ANGPTL4在炎症反应中的双重作用，反映了ANGPTL4在不同组织和细胞类型中的功能和表达的复杂机制，包括翻译后修饰、切割和寡聚化、选择性剪接、亚细胞定位和DNA甲基化等^[13]。有研究表明，ANGPTL4可以一定程度上抵消饱和脂肪酸在脂质代谢中的促炎作用，减少脂肪酸的脂溶性释放、泡沫细胞的形成、内质网应激以及炎症信号通路的激活^[14]。Cho等^[15]研究表明，在动脉粥样硬化小鼠体内注射ANGPTL4蛋白，可以下调KLF4的表达，抑制NOX1激活，抑制平滑肌细胞向泡沫样细胞的表型转化，使小鼠动脉斑块更加稳定，由此可见ANGPTL4可以通过抑制慢性病理性炎症反应发挥心脏保护作用。众多研究均证实ANGPTL4参与调节多种炎症反应，但其作用机制尚不明确。

在本研究中，通过RNA测序技术，分析脓毒症小鼠心肌组织中mRNA的表达情况，在后续的动物实验与细胞实验中，ANGPTL4在LPS诱导的脓毒症心肌损伤小鼠的心室组织和心肌细胞中均表达上调，这表明脓毒症机体损伤可能与ANGPTL4的表达增加存在相关性。而脓毒症可以诱导全身炎症反应和多脏器损伤，ANGPTL4在机体的心肌、肝脏、脂肪、肺脏等多组织都有分布表达^[16]。既往研究表明在严重的脓毒症和并发SC患者中，心肌线粒体的超微结构和功能被严重破坏^[17]，包括线粒体肿胀、细胞质变性、蛋白积聚和溶酶体损伤等^[18]，并激活细胞凋亡途径^[19]。为明确ANGPTL4参与脓毒症心肌损伤的作用机制，本研究构建了ANGPTL4的沉默和过表达载体，通过转染si-ANGPTL4和pc-ANGPTL4来调控ANGPTL4在心肌细胞中的表达，发现与对照组相比，si-ANGPTL4转染后心室肌细胞的增殖能力显著增强，并且心室肌细胞中Bax和Caspase3的表达明显下调，Bcl-2的表达则明显上调，心室肌细胞的凋亡率明显下降；而转染pc-ANGPTL4之后明显降低心室肌细胞的活力，促进心室肌细胞的凋亡。由此认为ANGPTL4有可能是SC的潜在治疗靶点之一，抑制ANGPTL4能够有效减轻脓毒症造成的急性心肌损伤。

本研究仍存在一定的局限性：未能检测临床患者的血清中ANGPTL4的表达情况，抑制ANGPTL4表达是否能减轻患者的病理损伤还需进一步实验验证。本实验表明ANGPTL4参与LPS诱导的心肌细胞凋亡，但涉及的相关诱导损伤因子、细胞凋亡具体机制和通路，以及ANGPTL4与氧化应激、线粒体作用的具体机制还需要进一步实验研究。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  梁雪、张伯阳：课题实施、论文撰写；王花玲李娇关思宇顾天舒：分子生物学实验、数据整理、统计学分析；李真玉：研究设计、实验指导、论文修改、经费支持