脓毒症（sepsis）患者异质性一直是脓毒症研究中的突出难题，2001年脓毒症定义Sepsis 2.0曾经对脓毒症进行了探索性划分，但其标准始终没有得到严格验证，由于时代的局限性未能得到推广应用。如今先进检测方法、分析技术和处理策略的发展为脓毒症深入研究提供了新契机^[1]，有望解决脓毒症异质性问题。脓毒症的异质性影响因素较多，可能与原发病类型、宿主反应、遗传背景等相关，从而导致临床表现和结局的差异。如果能明确脓毒症患者的具体亚型，则有利于获得精准的辅助诊疗信息，从而预测其病情的发展特点和演变趋势、帮助临床医师开展针对性个体化治疗，最终提高脓毒症救治成功率^[2]。

1 脓毒症分类回顾与探索

最初脓毒症概念是将其定义为感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），即“Sepsis 1.0”^[3]；但在临床实践中，该定义暴露出过于宽泛的缺点，很多非特异性病理过程都有可能被归入脓毒症范畴。2001年，美国危重病医学会、美国胸科医师协会及欧洲危重病医学会（SCCM/ACCP/ESICM）在华盛顿举行了联席会议并推出Sepsis 2.0定义。该定义在Sepsis 1.0基础上，参照恶性肿瘤的TNM（肿瘤/淋巴结/远处转移）分级系统，在4个方面对脓毒症的类型和评估进一步细化。这4个方面分别是易感因素（pre-disposition，P）、损伤性质（insult，I）、机体反应（response，R）以及伴发器官功能障碍（organ dysfunction，O），简称PIRO系统。但是，该分类系统仅对未来脓毒症研究提出的一个概念框架，其中提出的设想缺乏充分的研究基础和科学证据支持，并未形成完整而明确的标准体系。因此，Sepsis 2.0定义中的PIRO分类方法没有在临床实践中得以推广^[4]。最终，SCCM和ESICM于2016年联合提出了新版脓毒症定义，即“Sepsis 3.0”^[5]。尽管如此，Sepsis 2.0中的PIRO分类设想初步反映了学者们对于脓毒症异质性的思考和探索，期望通过PIRO系统来界定不同类型的脓毒症患者，从而为脓毒症治疗提供帮助。

2 基于临床表现和实验室指标分类

尽管具有类似的感染致病因素，但不同的患者具有不同的临床表现。有研究利用患者的基本生命体征进行分类。Bhavani等^[6]分析了来自美国埃默里医疗集团4家教学医院的可疑感染患者，其中12 473例患者收治于2014—2017年，作为训练集；另外8 256例患者收治于2018—2019年，作为验证集。研究确定了4种亚表型：(1) A组（n=3 483, 28%）有高热、心动过速、呼吸急促和低血压；(2) B组（n=1 578, 13%）与A组相同，表现较轻；(3) C组（n=4 044, 32%）和(4) D组（n=3 368, 27%）体温、心率和呼吸频率相对较低，其中C组血压正常，D组为低血压患者。Logistic回归分析证明，A组和D组30 d病死率更高（分别为P < 0.001和P=0.03），这两组患者血管活性药物的需要量显著大于其他两组。一项回顾性研究纳入了320例脓毒症患者并将其分为4种表型特征^[7]。表型1为多器官功能衰竭患者，表型2患者伴发神经功能障碍，表型3患者发生呼吸功能障，表型4为其他患者。分析显示，表型1患者病死率最高（48.4%），其次是神经系统功能障碍表型（39.7%）。另一项研究纳入了20 189例脓毒症患者，同样确定了四种表型^[8]：表型α患者使用血管加压素比率较低，表型β为伴有较多并发症的老年患者，表型γ患者炎症反应重多伴有呼吸衰竭，表型δ中肝衰竭和脓毒性休克的发生率较高。结果显示，δ表型患者的28 d和365 d病死率最高。有研究根据脓毒症患者的炎症反应及实验室指标进行亚型分类，将之分为为1类和2类^[9]。2类表现出更短的时间恶化伴高炎症性特点，致病后24 h出现更高的血清白细胞介素（IL）-6和IL-10浓度。此外，有学者探讨了脓毒症及脓毒性休克患者表型与潜在获益治疗中的临床价值。A型患者存在严重凝血功能紊乱，表现为高水平的纤维蛋白原降解产物（fibrinogen degradation products, FDP）和D-二聚体（D-dimer）、严重器官功能障碍和高病死率；B型病情重且表现为中度凝血紊乱；C型和D型病情相对较轻，伴或不伴有凝血功能紊乱^[10]。重组血栓调节蛋白（thrombomodulin）在A型患者中显示有效（显著降低28 d病死率及住院病死率），提示伴有高FDP和D-dimer的脓毒症患者可能适合接受血栓调节蛋白治疗。上述研究为脓毒症患者个体化管理与治疗提供了依据，但是临床队列研究在数据分析中可能存在偏差和限制，需要大样本前瞻性对照试验进一步论证。

3 针对免疫反应的亚型分类

免疫麻痹是脓毒症患者病情恶化的关键因素，一直是脓毒症研究热点。学者们致力于对脓毒症患者免疫状态进行甄别和分类，以明确免疫调节的治疗时机。较为经典的评估方案包括测定患者单核细胞人类白细胞DR抗原（human leukocyte antigen-DR, HLA-DR）表达、淋巴细胞计数和IL-6水平，用于识别免疫功能低下的患者，作为启动免疫治疗的参考。近年来，选择同质性患者的“富集策略”（enrichment strategy）受到关注，有助于推动临床精准医疗。例如，根据高死亡风险预后选择患者，进行“预后富集”，针对特定目标人群进行临床试验有望提高研究效率^[11]。目前，高通量组学技术的发展为富集脓毒症患者生物学相似性提供了便捷。Davenport等^[12]使用大量来自全血或白细胞的转录组数据，通过无监督聚类算法，描述了两种脓毒症反应转录组特征（sepsis response signatures, SRS1和SRS2）。SRS1患者富集细胞死亡、细胞凋亡、坏死和细胞毒性通路的转录本，内毒素耐受和免疫耗竭的转录模式在SRS1中也相对过表达。因此，SRS1型患者的临床结局比SRS2差，病死率明显升高，这一现象在临床随机对照试验中亦得到证实^[13]。业已明确，人体免疫系统的个体差异性较大，并在一段时间内保持相对稳定，因此，准确评估患者的免疫基线水平有助于精准免疫调理。新近有学者采用较新的细胞免疫检测技术对脓毒症患者进行表征分型。酶联免疫斑点技术（enzyme linked immunospot assay, ELISpot）能够在单细胞水平对细胞因子分泌情况进行检测，具有更髙的灵敏性。例如，有研究通过全血ELISpot检测离体白细胞产生细胞因子的能力，分别纳入46名健康对照患者、68例无脓毒症患者和107例脓毒症患者，分析肿瘤坏死因子（TNF）-α（内毒素刺激）和干扰素（IFN）-γ诱生水平（抗CD3/CD28抗体刺激）^[14]。结果证实，全血TNF-α表达增加与临床结果改善相关，且其良好出院率和180 d生存率显著升高。因此，根据离体血细胞功能识别脓毒症患者类型是可行手段之一。此外，还可以在体外进行内毒素或者环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cGAMP）刺激实验，评估患者的免疫储备能力。当然，单一指标难以全面评估免疫功能，而多种方法、多个指标组合有望更准确地反映患者免疫状态，包括细胞信号分子与转导方式、免疫细胞亚型及其活化特点等。只有精准描绘与刻画机体免疫力“全貌”，指导需要干预的目标和时机，才可能有效促进脓毒症诊疗新策略的进步^[15]。

4 基于基因特征的亚型分类

Sweeney等^[16]联合多个公共数据库的组合数据集，通过无监督聚类方法进行脓毒症患者的基因转录组学分析，共使用33个转录本进行验证分类。他们将研究人群分为“炎症型”、“适应型”和“凝血型”，其中适应型集群的病死率最低，这种合并研究设计的方法可扩大研究人群，提高研究结论的普适性。另有学者进一步验证了Sweeney等^[16]报道的分类方法，选择相对少的转录本，共使用13个脓毒症数据集，评估了接受皮质类固醇治疗的不同人群预后，为脓毒症皮质类固醇治疗提供研究证据^[17]。此外，有人在ADRENAL试验中采用全血RNA测序，探讨白细胞中肾上腺皮质激素相关基因表达对治疗结局的预测价值^[18]。整体研究结果是阴性的，没有发现候选基因表达水平与皮质类固醇治疗结局相关，两组患者之间病死率和休克改善情况差异无统计学意义。但是，在其中2个肾上腺皮质基因库数据中，Logistic分析显示出阳性结果，基因表达差异与皮质类固醇激素改善休克状态具有显著相关性。由于明确的结论还需要进一步探讨，该研究结果尚不足以在临床实践中推广应用。

近年来，前沿创新技术不断涌现，相对批量RNA测序而言，单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法发展迅速，可以针对特定的免疫细胞进行解析，例如白细胞，从而得到更为精细的信息^[19]。Reyes等^[20]收集了29例脓毒症患者的血液单核细胞并利用scRNA-seq进行分析，将单核细胞状态（monocyte status, MS）分为4种亚型（MS1-4）。其中，MS1是CD14⁺细胞，高表达抵抗素（resistin gene, RETN）、花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白（ALOX5AP）和IL-1受体2；MS2细胞的特征是高表达主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅱ，MS3为非经典CD16高表达的单核细胞，MS4系其他的MHC-Ⅱ和细胞因子低表达CD14⁺细胞。研究结果证实，脓毒症患者MS1单核细胞明显增加。而且，MS1单核细胞中线粒体呼吸相关基因低表达预示患者病情危重，其SOFA评分升高。说明能量衰竭是导致免疫麻痹的内在机制之一。进一步实验发现，MS1单核细胞对体外内毒素刺激的反应性较差，活化能力明显弱于健康志愿者的外周单核细胞。因此，scRNA-seq很可能成为脓毒症患者评估有力手段之一^[21]。

5 挑战与展望

脓毒症病情极其复杂，涉及到多个器官、不同系统，可由多种病因诱发，且不同患者炎症反应与免疫状态也千差万别，这无疑显著增加了脓毒症患者治疗的难度。针对不同患者实施个体化治疗有利于提高危重症救治成功率。因此，脓毒症亚型研究具有临床应用价值，也是实施精准诊疗的重要基础。脓毒症亚型表征离不开大数据分析手段的更新与提高，机器学习方法在分类中发挥关键作用^[22]。其中，聚类分析是一种非监督的机器学习算法，可以建立在无给定划分类别的情况下，根据数据相似程度进行样本分组；从而避免了人为干预，自动在海量数据中确定内在特点，对于解析脓毒症亚型具有显著临床意义。

需要强调的是，单一或者少数指标可能不足以明确脓毒症的类型，不同形式的多模态组合指标是未来发展趋势之一。可以联合基因、蛋白及代谢组学、临床体征、治疗反应等多种类型数据，进一步提高脓毒症亚型分类的准确性与有效性^[23-24]。通过新的分析方法和前沿技术，可以发现潜在的特征基因及其他生物标志物。例如，我们通过单细胞转录组分析，发现并鉴定了一群新型具有免疫抑制功能单核细胞，为脓毒症个体化免疫调理提供了新线索^[25]。此外，研究者利用基因差异分析、无监督分层聚类方法寻找新的预测基因簇^[26]；通过细胞外泌体和中性粒细胞胞外诱捕网关键调控基因的挖掘^[27-28]，为脓毒症干预靶点探索开辟了新途径。总之，随着技术方法的快速发展，可以将基因、蛋白、细胞、临床数据甚至影像组学等不同层面、不同尺度、不同模态的数据大规模整合，借助人工智能等先进手段进行融合分析，将促进脓毒症亚型研究领域的不断进步与深刻变革。

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