2024, Vol. 33
2. 南通大学附属医院急诊医学科，南通 226006;
3. 南通大学急诊教研室，南通 226004;
4. 南通大学特种医学研究院，南通 226019
2. Department of Emergency Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong, 226200, China;
3. Department of Emergency Medicine, Nantong University, Nantong, 226200, China;
4. Institute of Special Environmental Medicine, Nantong University, Nantong, 226019, China
脓毒症是由于感染引发的全身性炎症反应综合征，导致器官功能衰竭[1-2]。脓毒症不仅对全身各个器官造成损害，也导致一系列神经功能障碍，称为脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）。SAE临床表现为急剧恶化的精神状态，并且SAE患者住院时间较长、病死率较高[3-4]。
肠道微生态失衡被认为是脓毒症发生的重要因素[5]。特别是肠道微生态与中枢神经系统之间存在密切的交互作用，即所谓的“脑-肠轴”，这种交互作用在SAE的发生发展中起着关键作用[6-7]。内源性肠道菌群如双歧杆菌和乳酸杆菌可产生中枢神经系统抑制性神经递质γ-氨基丁酸，改变神经信号。SAE期间肠道菌群产生的短链脂肪酸减少，无法下调炎症，导致体内炎症标志物和内毒素增加[8]。因此针对SAE体内肠道菌群失衡，粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）从健康个体中获取完整的肠道生态系统，包括不同比例的多种微生物物种以及负责免疫调节的必要底物和代谢物，并将该菌群转移到患者体内[9-10]。FMT已证明在预防或治疗神经精神疾病方面具有潜在的神经保护作用[11-12]。有研究用FMT干预SAE小鼠，随后评估认知变化、肠道微生物组的变化，全身和神经炎症标志物的变化。结果发现FMT恢复了与SAE相关的神经认知缺陷[13]。核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）广泛参与调控炎症反应、免疫应答以及细胞存活[14]。有研究指出短链脂肪酸显着逆转SAE小鼠的反射和感觉功能、神经精神状态和运动行为损伤。它们还可以显着增加与血脑屏障完整性相关的紧密连接蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）和occludin水平，并通过抑制SAE模型中的NF-κB信号通路来显着抑制神经炎症[15]。NLRP3炎性小体是一种由NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、细胞凋亡相关斑点样蛋白含卡他亲和结构域（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和caspase-1组成的胞内多蛋白复合体，是天然免疫系统中重要的炎症调控因子[14]。NLRP3炎性小体的活化在许多炎症性疾病包括SAE中发挥关键作用。研究指出NLRP3/Caspase-1途径诱导的焦亡在SAE模型中介导认知缺陷[16]。
因此，研究NF-κB/NLRP3信号通路在SAE中的具体作用及其调控机制，对于开发新的治疗策略具有重要意义。然而，FMT在治疗SAE中的机制尚未完全阐明。本研究旨在通过建立SAE大鼠模型，探索FMT如何通过调节肠道菌群组成及功能，并抑制NF-κB/NLRP3信号通路，进而改善SAE的病理过程。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组30只清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200~250 g，由南通大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK（苏）2020-0029。适应性饲养1周后按随机数字表法分为假手术（sham）组、SAE组、SAE+FMT组，SAE+FMT+ NF-κB激动剂[Diprovocim（HY-123942，美国MCE公司）]组，SAE+FMT+NLRP3激动剂[尼日利亚霉素（HY-100381，美国MCE公司）]组，每组6只。
1.2 模型制备及分组给药处理本实验中动物处置方法经南通大学伦理委员会审批（审批号：S20230727-004）。大鼠吸入异氟烷麻醉，经尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（O55：B5，美国Sigma公司）10 mg/kg制备SAE大鼠模型；sham组给予等量生理盐水。FMT组于制模后1 d将正常大鼠粪便稀释分离后取上清液2 mL灌胃，每日3次；对照组灌胃等量生理盐水。SAE+FMT+NF-κB激动剂组，SAE+FMT+NLRP3激动剂组，在FMT之前1 h分别腹腔注射NF-κB激动剂Diprovocim 5 mg/kg[17]，NLRP3激动剂尼日利亚霉素1 mg/kg[18]。
1.3 标本采集大鼠制模后第7天结束所有的神经功能评估后，CO2安乐死大鼠，取得各组大鼠新鲜粪便1 g，血清，脑组织，肝肾组织。部分脑组织固定在多聚甲醛，部分脑组织存入-80℃冰箱。
1.4 检测指标及方法 1.4.1 肠道菌群分析采用16S rDNA高通量基因测序技术分析大鼠粪便样本中的菌群组成。样本送往苏州帕诺米克生物医药科技公司，DNA提取后，利用特异性引物扩增V3-V4区域，并进行Illumina MiSeq平台测序分析。
1.4.2 改良NSS（modified neurological severity score，mNSS）评分制模后第7天根据mNSS的评分标准，对大鼠的运动功能、感觉功能、平衡功能以及反射等进行评分。记录每项测试的得分。将所有测试的得分汇总，得到总分。
1.4.3 Morris水迷宫检测造模后第3、4、5、6天行Morris水迷宫测试空间学习记忆能力，第7天行空间探索实验，分别记录大鼠找到平台的时间以及在目标象限的停留时间。
1.4.4 生化检测肝肾功能使用生化分析仪器（日立3110，日本）对血清中的丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）以及血清肌酐（serum creatinine，Scr）进行测定。
1.4.5 尼氏染色将脑组织在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，通过70%、80%、90%、100%浓度递增的酒精溶液脱水。随后使用二甲苯透明化，进行包埋、切片和脱蜡，以及重水处理。切片浸入焦油紫染液（上海泽叶生物科技有限公司）中染色10 min，然后在酒精中轻轻脱色直至仅尼氏体着色，使用蒸馏水冲洗。最后封片，用光学显微镜（Nikon Eclipse Ci-L，日本）观察。
1.4.6 蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）脑组织蛋白经过溶解、离心、电泳、显影等步骤后，用Image J软件分析，以目的蛋白NF-κB（#AF5006，美国Affinity公司），NLRP3（#BF8029，美国Affinity公司），ASC（#DF6304，美国Affinity公司），pro-IL-1β（#AF4006，美国Affinity公司）条带与内参条带β- 肌动蛋白（β-actin）（#AF7018，美国Affinity公司）吸光度比值作为目的蛋白表达量。
1.4.7 定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）使用匀浆器将脑组织匀浆，提取总RNA，使用逆转录试剂盒（HiScript IV RT SuperMix for qPCR，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将提取的RNA逆转录成cDNA。针对目标基因设计特异性引物，加入荧光标记探针，通过荧光信号的变化定检测Claudin-5、Occludin、ZO-1、NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18、NF-κB、TLR4、MyD88基因的表达水平。以内参基因（GAPDH）作为标准化的参照。
1.5 统计学方法采用SPSS统计软件进行数据分析，对所有数据若符合正态分布且符合方差齐性检验，用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用Tukey检验；若符合正态分布但方差不齐，则采用Dunnett's T3检验；若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验。显著性水平α=0.05。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 FMT后的SAE大鼠肠道菌群多样性增加，有益菌群增加16S rRNA测序结果显示SAE大鼠α多样性指标chao1（F=10.22，P < 0.01），observed-species（F=14.45，P < 0.01）相较于sham组降低，而FMT组大鼠的α多样性指标chao1，observed-species均有所升高（图 1A，P < 0.01或P < 0.05），图 1B通过距离矩阵与PCoA分析检测肠道菌群的β多样性，结果显示SAE大鼠与sham组和FMT大鼠有部分菌群重合。图 1C-D显示门及属水平物种组成柱状图，发现SAE组有益菌Bacteroidete，Clostridiales相比sham组减少，在FMT组中增加。但是占大部分的维护肠道健康、增强免疫力和防止有害细菌过度生长方面发挥作用的益生菌Lactobacillus在SAE大量增加。Ruminococcaceae细菌参与纤维分解和短链脂肪酸的产生，在SAE组中相比于sham组减少。图 1E-G展示不同组别样本中的细菌前10个门和属序列丰度。
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| A: α多样性指数，横坐标为分组标签，纵坐标为相应α多样性指数的值。B: β多样性指数，图中每个点代表一个样本，不同颜色的点指示不同的组; 坐标轴百分比代表了对应的坐标轴所能解释的样本差异数据（距离矩阵）的比例; C-D: 门以及属水平物种组成柱状图，取样本平均序列丰度最高的前10个门和属进行展示; E：韦恩图; F-G：横坐标为对应于韦恩图不同区域的ASV/OTU集合，纵坐标为属于不同门和属的序列丰度的百分比例，不同的分类单元以不同颜色标识；取样本平均序列丰度最高的前10个门和属进行展示。每组n=6。与假手术组（Sham）比较，aP＜0.01，与SAE比较，bP＜0.01 图 1 FMT后各组大鼠16s rRNA测序肠道菌群分析 Fig 1 Analysis of gut microbiota in different rat groups by 16S rRNA sequencing following FMT (Fecal Microbiota Transplantation) |
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图 2A显示，经过7 d后，SAE处理的大鼠在神经行为学评分（mNSS）上相比sham显著降低（F=80.05，P < 0.01），FMT处理后mNSS评分显著提高（P < 0.01）。NF-κB和NLRP3激动剂处理的组别的mNSS评分相比FMT组有所下降（P < 0.01）。图 2B展示在第7天的大鼠在水迷宫中的学习和记忆轨迹，图 2C展示了大鼠在第3、4、5、6天找到平台的时间，与sham组比较，SAE组通过找到平台的时间明显增加，在目的象限停留的时间缩短（P < 0.05）；FMT大鼠与SAE大鼠相比找到平台的时间减少，特别是在实验第3天（F=12.66，P < 0.05），第4天（F=15.60，P < 0.01），FMT大鼠在目的象限停留的时间增加（F=28.46，P < 0.05），而NF-κB激动剂组和NLRP3激动剂组效果与FMT相反。图 2D表明SAE组大鼠的血清生化指标ALT（F=90.30）、AST（F=254.33）、Scr（F=73.87）、BUN（F=102.29）与sham大鼠相比显著升高（P < 0.01），FMT后这些指标显著下降（P < 0.01或P < 0.05），而NF-κB和NLRP3激动剂组抵消了FMT的正面效果（P < 0.01）。图 2E通过ELISA检测，SAE组IL-6（F=583.90）、IL-1β（F=48.90）、TNF-α（F=113.28）显著增加（P < 0.01），FMT处理后这些炎症指标显著下降（P < 0.01），NF-κB和NLRP3激动剂处理组抵消了FMT的效果（P < 0.01）。
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| A：改良NSS（mNSS）评估第7天大鼠神经行为学，每组n=6；B：第3、4、5、6天的大鼠在水迷宫中的学习和记忆轨迹；C：大鼠找到平台的时间以及目的象限停留的时间，每组n=5；D：大鼠血清中的肝肾功能指标的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清肌酐（Scr）以及血尿素氮（BUN）的表达，每组n=6；E：ELISA检测脑组织中IL-6，IL-1β，TNF-α炎症因子表达，每组n=6。与Sham比较，aP＜0.01，与SAE比较，bP＜0.01，与SAE+FMT比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 2 NF-κB及NLRP3激动剂抵消FMT对大鼠神经保护作用及抑炎反应 Fig 2 NF-κB and NLRP3 agonists negate the neuroprotective and anti-inflammatory effects of FMT in rats |
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图 3A的尼氏染色观察发现，SAE处理的大鼠海马CA1区神经元数量减少（F=43.94）（P < 0.01），FMT处理后相对于SAE组神经元数量有所增加（P < 0.05），而NF-κB和NLRP3激动剂组抵消了FMT的效果。图 3B的qRT-PCR检测表明，SAE大鼠脑组织Claudin-5（F=88.56），Occludin（F=58.48），ZO-1（F=26.48），ASC（F=70.24），IL-1β（F=41.53），IL-18（F=32.09），NLRP3（F=57.72），NF-κB（F=15.50），TLR4（F=24.09），MyD88（F=18.29）相比sham大鼠增加（P < 0.01），FMT后这些指标明显下降（P < 0.01），NF-κB激动剂组和NLRP3激动剂组抵消了FMT的作用（P < 0.01）。图 3C通过Western blot检测，FMT后脑组织中的NF-κB（F=1739.3），NLRP3（F=110.02），ASC（F=1387.00），Pro-IL-1β（F=25.17）蛋白表达相对于SAE组降低（P < 0.01），NF-κB激动剂组和NLRP3激动剂组抵消了FMT的作用（P < 0.01）。
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| A：尼氏染色观察海马组织的神经元变化以及CA1区神经元数量统计，比例尺200 μm，放大200倍。每组n=6；B：定量逆转录聚合酶链反应检测大鼠脑组织Claudin-5，Occludin，ZO-1，ASC，IL-1β，IL-18，NLRP3，NF-κB，TLR4，MyD88，每组n=3；C：蛋白质免疫印迹检测脑组织NF-κB，NLRP3，ASC，Pro-IL-1β，蛋白表达，每组n=3；与Sham比较，aP＜0.01，与SAE比较，bP＜0.01，与SAE+FMT比较，cP＜0.05，dP＜0.01 图 3 NF-κB及NLRP3激动剂抵消FMT对大鼠神经保护作用及抑炎反应 Fig 3 NF-κB and NLRP3 agonists counteract the neuroprotective and anti-inflammatory responses induced by FMT in rats |
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肠道生态失调与脓毒症病死率密切相关[19]，FMT后肠道菌群的改变可能是通过脑-肠轴影响SAE治疗效果的关键因素[20]。SAE可抑制有益细菌（如lachnospiraceae_NK4A136_group）的生长、促进有害细菌（如志贺氏菌）的增殖和加重代谢紊乱[21]。严重脓毒症患者双歧杆菌和乳杆菌减少，致病性葡萄球菌和假单胞菌定植增加[22]。本研究显示，FMT能显著改善SAE的肠道菌群多样性，16S rRNA报告显示SAE组有益菌Bacteroidete，Clostridiales减少，在FMT中增加。但是占大部分的维护肠道健康、增强免疫力和防止有害细菌过度生长方面发挥作用的益生菌Lactobacillus在SAE大量增加，推测是SAE后体内的应激反应，机体进行代偿，在FMT组恢复至正常水平。Ruminococcaceae细菌参与纤维分解和短链脂肪酸的产生，在SAE组中减少，加剧神经系统损伤，进一步证实了肠道微生态在SAE发病机制中的核心作用。
FMT可通过调节免疫反应来治疗SAE[21]。本研究显示SAE大鼠神经元，mNSS评分，学习记忆能力都有所下降，而FMT改善了大鼠的神经功能。另一方面，脓毒症诱导肠壁通透性，使细菌抗原与肠道常驻免疫细胞相互作用并影响全身免疫[23-24, 26]。本研究结果SAE大鼠血清炎症因子升高，FMT显著改善炎症反应。
短链脂肪酸可通过NF-κB途径降低促炎细胞因子的表达。Fu等[16]表明短链脂肪酸可以通过独立于过氧化物酶体增殖物激活受体-γ激活的结肠NLRP3炎症小体来改善神经炎症。本研究显示FMT抑制SAE大鼠脑内的NF-κB/NLRP3信号通路，NF-κB/NLRP3激动剂抵消了FMT的治疗作用。
综上所述，FMT通过调节肠道菌群，抑制NF-κB/NLRP3信号通路的激活，为SAE的治疗提供了新的策略，但本研究FMT样本数量较小，且为动物研究，这限制了结果的普遍适用性和在人类中的有效性。其长期效果和潜在风险仍然不清楚。未来的研究需要进一步阐明FMT对肠道菌群的具体调控机制，从而为临床应用奠定更坚实的基础。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 袁晓宇：实验操作、论文撰写；赵红睿，王国华：数据收集及整理、统计学分析；徐峰：研究设计、论文修改
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